【摘要】：咪唑是一種生物弱堿,它是生物體內(nèi)組胺、組氨酸發(fā)揮生理作用的重要基團。咪唑及其衍生物廣泛應用在不同類型的藥物中,顯示出不同的藥理活性,如抗菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲、拮抗組胺受體等。尤其作為抗癌藥物,咪唑顯示了廣闊的應用前景。該領域已經(jīng)取得了許多重要成果,其中多個咪唑類化合物已作為抗癌藥物應用于臨床。然而,咪唑類藥物的抗癌機制尚不完全清楚。細胞自噬和凋亡與癌癥的發(fā)生密切相關,目前,絕大多數(shù)化療藥物主要是通過抑制自噬和促進凋亡來實現(xiàn)癌癥治療目的。因此,本論文以人子宮內(nèi)膜腺上皮癌細胞(HEC-1B)為材料,系統(tǒng)地研究分析咪唑?qū)毎允珊偷蛲龅挠绊?旨在揭示咪唑類藥物抗癌作用的分子機制。在自噬方面：(1)較低濃度的咪唑(5-25mM)能夠在6h內(nèi)引起HEC-1B細胞空泡化,通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)咪唑能夠明顯地升高自噬體標志物LC3-II的含量,進一步利用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)咪唑誘導胞內(nèi)產(chǎn)生大量自噬體樣囊泡(AVs),表明咪唑影響細胞的自噬過程；(2)Western blotting檢測顯示咪唑并未對自噬啟動相關激酶及分子產(chǎn)生明顯影響,表明咪唑處理并未啟動細胞的自噬；(3)在咪唑處理的細胞中EGFP-LC3呈點狀分布,游離EGFP蛋白水平顯著下降,進一步通過Western blotting檢測表明咪唑處理顯著增加p62蛋白水平,并且BafA1抑制并未提高咪唑處理細胞內(nèi)LC3-II的水平,表明咪唑阻斷自噬物的降解；(4)利用激光共聚焦檢測mRFP-GFP-LC3的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)咪唑能夠增加自噬體的數(shù)量,但未檢測到自噬溶酶體數(shù)量增加,表明咪唑抑制自噬體成熟為自噬溶酶體。在凋亡方面：(1)較高濃度的咪唑(50-100mM)能夠在12-48h顯著地抑制HEC-1B細胞存活,Western blotting檢測顯示咪唑處理引起caspase9和caspase3斷裂,表明咪唑能夠誘導細胞凋亡；(2)利用RT-PCR和Western blotting檢測促凋亡蛋白Bim的表達,結(jié)果表明咪唑處理導致Bim mRNA和蛋白水平表達顯著升高;(3)通過Western blotting和蛋白超表達檢測咪唑?qū)D(zhuǎn)錄因子Fox03a的影響,結(jié)果顯示,咪唑能夠誘導FoxO3a蛋白上調(diào)并促進其入核；(4)進一步研究發(fā)現(xiàn)siRNA介導的FoxO3a基因沉默顯著地抑制咪唑引起的Bim上調(diào),并降低細胞的死亡率,表明咪唑通過激活Fox03a上調(diào)Bim的表達。綜上所述,咪唑通過抑制自噬體成熟從而阻斷自噬體的降解：同時,咪唑通過FoxO3a-Bim通路誘導細胞凋亡。本研究結(jié)果明晰了咪唑?qū)EC-1B細胞自噬和凋亡作用的分子機制,并且為進一步研發(fā)咪唑類抗癌藥物提供了有價值的科學依據(jù)。
[Abstract]:Imidazole is a weak alkaloid. It is an important group of histamine and histidine in organism. Imidazole and its derivatives are widely used in different types of drugs, showing different pharmacological activities, such as antibacterial, antifungal, anti-virus, anti-parasite, antagonistic histamine receptor and so on. Especially as an anticancer drug, imidazole has shown a broad application prospect. Many important achievements have been made in this field, and many imidazole compounds have been used as anticancer drugs in clinic. However, the anti-cancer mechanism of imidazole drugs is not completely clear. Autophagy and apoptosis are closely related to the occurrence of cancer. At present, the majority of chemotherapeutic drugs are mainly through inhibiting autophagy and promoting apoptosis to achieve the purpose of cancer treatment. In this study, the effects of imidazole on autophagy and apoptosis of human endometrial adenocarcinoma cell line (HEC-1B) were systematically studied in order to reveal the molecular mechanism of anti-cancer effect of imidazole drugs. In autophagy: (1) low concentration of imidazole (5-25mM) could induce vacuolation of HEC-1B cells within 6 hours. Western blotting assay showed that imidazole could significantly increase the content of LC3-II, a marker of autophagy. Furthermore, transmission electron microscopy (TEM) showed that imidazole induced a large number of autophagy-like vesicles (AVs), indicating that imidazole affected the autophagy process of cells. (2) Western blotting assay showed that imidazole did not significantly affect autophagy-priming-related kinases and molecules, indicating that imidazole-treated cells did not initiate autophagy. (3) in the cells treated with imidazole, EGFP-LC3 distributed in dot shape and the level of free EGFP protein decreased significantly. Further Western blotting analysis showed that the level of p62 protein was significantly increased by imidazole treatment. The inhibition of BafA1 did not increase the level of LC3-II in the cells treated with imidazole, which indicated that imidazole blocked the degradation of autophagy. (4) Laser confocal detection of subcellular localization of mRFP-GFP-LC3 showed that imidazole could increase the number of autophages, but no increase in the number of autophagy lysosomes was detected, indicating that imidazole inhibited autophagy maturation to autophagy lysosomes. In the aspect of apoptosis: (1) High concentration of imidazole (50-100mM) could significantly inhibit the survival of HEC-1B cells at 12 h., Western blotting assay showed that caspase9 and caspase3 breaks were induced by imidazole treatment, indicating that imidazole could induce apoptosis of HEC-1B cells. (2) RT-PCR and Western blotting were used to detect the expression of pro-apoptotic protein Bim. The results showed that the expression of Bim mRNA and protein was significantly increased by imidazole treatment. (3) the effect of imidazole on transcription factor Fox03a was detected by Western blotting and protein overexpression. The results showed that imidazole could induce the upregulation of FoxO3a protein and promote its entry into nucleus. (4) further studies showed that siRNA-mediated FoxO3a gene silencing significantly inhibited Bim upregulation induced by imidazole and reduced cell mortality, suggesting that imidazole up-regulated Bim expression by activating Fox03a. In conclusion, imidazole blocks autophagy degradation by inhibiting autophagy maturation; at the same time, imidazole induces apoptosis through FoxO3a-Bim pathway. The results of this study have clarified the molecular mechanism of imidazole on autophagy and apoptosis of HEC-1B cells and provided valuable scientific basis for further research and development of imidazolium anticancer drugs.
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【共引文獻】

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本文編號：2430558