【摘要】：目的:代謝綜合征已成為世界范圍內(nèi)的健康問題。以高血糖、肥胖、高血壓和胰島素抵抗為主要特征的代謝綜合征及其合并癥,對(duì)人群健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。胰島素抵抗及其相關(guān)的代謝綜合征與育齡期女性的生殖問題密切相關(guān)。在哺乳動(dòng)物中,子宮內(nèi)膜蛻膜化是妊娠的一個(gè)重要過程。異常的子宮內(nèi)膜蛻膜化與眾多的妊娠異常,如不孕、流產(chǎn)、先兆子癇、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩,以及早產(chǎn)密切相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高水平胰島素對(duì)早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化有影響,但其機(jī)制尚不明確。有研究已經(jīng)證實(shí)胰島素可通過一系列信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡,且子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡平衡是蛻膜化正常進(jìn)行的重要保證。因此,本文旨在研究高水平胰島素對(duì)妊娠早期子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響,并進(jìn)一步探討其可能作用機(jī)制。方法:1.動(dòng)物模型的建立及標(biāo)本收集:購買8周齡昆明鼠飼養(yǎng),分別皮下注射生理鹽水或胰島素建立正常組和高胰島素小鼠模型。正常妊娠小鼠模型的建立:將正常組和高胰島素組雌鼠與正常雄鼠進(jìn)行交配,次日見陰栓記為正常妊娠第一天,標(biāo)記為D1,分別測(cè)兩組正常妊娠第六天(D6)、第七天(D7)、第八天(D8)的尾靜脈血血糖,并收集兩組孕D6、D7、D8的血清和子宮組織用于后續(xù)研究。假孕小鼠模型的建立:將正常組和高胰島素雌鼠與結(jié)扎輸精管的雄鼠進(jìn)行交配,次日見陰栓記為假孕第一天,標(biāo)記為PD1,分別收集兩組假孕第六天(PD6)、假孕第八天(PD8)的子宮組織用于后續(xù)研究。人工誘導(dǎo)蛻膜化小鼠模型的建立:正常組與高胰島素組小鼠假孕第四天(PD4)一側(cè)宮角注射玉米油誘導(dǎo)蛻膜化,對(duì)照側(cè)宮角不作處理作為對(duì)照,于假孕第八天(PD8)收集人工誘導(dǎo)蛻膜化小鼠的蛻膜側(cè)子宮組織用于后續(xù)研究。2.高水平胰島素對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜凋亡的影響:(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常組與高胰島素組小鼠孕D6、D7、D8子宮內(nèi)膜細(xì)胞以及人工誘導(dǎo)蛻膜化小鼠子宮蛻膜側(cè)的細(xì)胞調(diào)亡水平;(2)透射電鏡觀察正常組與高胰島素組小鼠孕第八天(D8)子宮內(nèi)膜的凋亡小體;(3)RT-PCR檢測(cè)正常組與高胰島素組小鼠孕D6、D7、D8子宮內(nèi)膜以及人工誘導(dǎo)蛻膜化小鼠子宮蛻膜側(cè)Bax、Bcl2的表達(dá);(4)免疫組化檢測(cè)正常組與高胰島素組小鼠孕D7、D8子宮內(nèi)膜Bax的表達(dá);(5)Western blot檢測(cè)正常組與高胰島素組小鼠孕D6、D7、D8,假孕PD6、PD8和人工誘導(dǎo)蛻膜化小鼠蛻膜側(cè)子宮凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。3.PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與高水平胰島素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響:(1)Western blot檢測(cè)子宮內(nèi)膜PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá);(2)正常組與高胰島素組小鼠子宮宮角注射PI3K/Akt信號(hào)通路特異抑制劑LY294002后,進(jìn)一步分析PI3K/Akt信號(hào)通路是否參與高水平胰島素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響。4.原代分離培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞并體外誘導(dǎo)蛻膜化:小鼠子宮內(nèi)膜組織分離提取基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),免疫熒光檢測(cè)Vimentin進(jìn)行基質(zhì)細(xì)胞純度鑒定。利用雌、孕激素對(duì)正常組與高胰島素組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)蛻膜化,RT-PCR檢測(cè)蛻膜化標(biāo)志分子dtprp的表達(dá)。5.高水平胰島素對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化后凋亡以及蛻膜化的影響:(1)高胰島素組和正常組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化后,采用流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL的方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡;(2)JC-1檢測(cè)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化后細(xì)胞色素C的釋放;(3)高胰島素組和正常組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化后,Western blot檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá),以及凋亡和蛻膜化相關(guān)蛋白的表達(dá);(4)加入PI3K/Akt信號(hào)通路特異抑制劑LY294002后,進(jìn)一步分析PI3K/Akt信號(hào)通路是否參與高水平胰島素對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化后凋亡以及蛻膜化的影響。結(jié)果:1.高水平胰島素小鼠模型的建立:早孕小鼠斷頸處死前,尾靜脈血測(cè)血糖結(jié)果顯示高胰島素組小鼠血糖明顯升高;ELISA結(jié)果顯示高胰島素組孕鼠血清中胰島素水平明顯升高。2.高水平胰島素對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜凋亡的影響:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示高胰島素組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡水平顯著降低;透射電鏡結(jié)果顯示高水平胰島素組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡小體明顯減少;Bax的RT-PCR結(jié)果和Bax的免疫組化結(jié)果一致,顯示高胰島素組子宮內(nèi)膜Bax表達(dá)明顯下降;Western blot結(jié)果顯示高胰島素組Bax、cleaved-Casepase3、cleaved-PARP表達(dá)顯著降低而Bcl2表達(dá)明顯升高。3.PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與高水平胰島素對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響:Western blot的結(jié)果顯示在高胰島素組中,小鼠子宮內(nèi)膜PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯改變。然而,抑制劑LY294002能夠顯著恢復(fù)高水平胰島素對(duì)早孕小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響。4.高水平胰島素對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化后凋亡的影響:高胰島素組和正常組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化后,流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL、JC-1以及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示高胰島素組凋亡水平顯著降低。然而,抑制劑LY294002能夠改善高水平胰島素對(duì)原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化后凋亡的影響。5.高水平胰島素對(duì)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化的影響:RT-PCR結(jié)果顯示在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)蛻膜化模型中,高胰島素組蛻膜化相關(guān)因子dtptp表達(dá)明顯降低。同時(shí),Western blot的結(jié)果顯示蛻膜化相關(guān)蛋白在高胰島素組中受到明顯抑制,表明高胰島素組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞體外蛻膜化受到顯著影響。然而,抑制劑LY294002能夠顯著改善高水平胰島素對(duì)原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化后的影響。結(jié)論:研究表明高水平胰島素可能打破子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的平衡進(jìn)而影響子宮內(nèi)膜蛻膜化,PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與其中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R714.2

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本文編號(hào)：2420812