【摘要】：目的:代謝綜合征已成為世界范圍內(nèi)的健康問題。以高血糖、肥胖、高血壓和胰島素抵抗為主要特征的代謝綜合征及其合并癥,對人群健康構(gòu)成嚴重威脅。胰島素抵抗及其相關的代謝綜合征與育齡期女性的生殖問題密切相關。在哺乳動物中,子宮內(nèi)膜蛻膜化是妊娠的一個重要過程。異常的子宮內(nèi)膜蛻膜化與眾多的妊娠異常,如不孕、流產(chǎn)、先兆子癇、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩,以及早產(chǎn)密切相關。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)高水平胰島素對早孕小鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化有影響,但其機制尚不明確。有研究已經(jīng)證實胰島素可通過一系列信號通路調(diào)節(jié)細胞凋亡,且子宮內(nèi)膜細胞的凋亡平衡是蛻膜化正常進行的重要保證。因此,本文旨在研究高水平胰島素對妊娠早期子宮內(nèi)膜細胞凋亡的影響,并進一步探討其可能作用機制。方法:1.動物模型的建立及標本收集:購買8周齡昆明鼠飼養(yǎng),分別皮下注射生理鹽水或胰島素建立正常組和高胰島素小鼠模型。正常妊娠小鼠模型的建立:將正常組和高胰島素組雌鼠與正常雄鼠進行交配,次日見陰栓記為正常妊娠第一天,標記為D1,分別測兩組正常妊娠第六天(D6)、第七天(D7)、第八天(D8)的尾靜脈血血糖,并收集兩組孕D6、D7、D8的血清和子宮組織用于后續(xù)研究。假孕小鼠模型的建立:將正常組和高胰島素雌鼠與結(jié)扎輸精管的雄鼠進行交配,次日見陰栓記為假孕第一天,標記為PD1,分別收集兩組假孕第六天(PD6)、假孕第八天(PD8)的子宮組織用于后續(xù)研究。人工誘導蛻膜化小鼠模型的建立:正常組與高胰島素組小鼠假孕第四天(PD4)一側(cè)宮角注射玉米油誘導蛻膜化,對照側(cè)宮角不作處理作為對照,于假孕第八天(PD8)收集人工誘導蛻膜化小鼠的蛻膜側(cè)子宮組織用于后續(xù)研究。2.高水平胰島素對小鼠子宮內(nèi)膜凋亡的影響:(1)流式細胞術(shù)檢測正常組與高胰島素組小鼠孕D6、D7、D8子宮內(nèi)膜細胞以及人工誘導蛻膜化小鼠子宮蛻膜側(cè)的細胞調(diào)亡水平;(2)透射電鏡觀察正常組與高胰島素組小鼠孕第八天(D8)子宮內(nèi)膜的凋亡小體;(3)RT-PCR檢測正常組與高胰島素組小鼠孕D6、D7、D8子宮內(nèi)膜以及人工誘導蛻膜化小鼠子宮蛻膜側(cè)Bax、Bcl2的表達;(4)免疫組化檢測正常組與高胰島素組小鼠孕D7、D8子宮內(nèi)膜Bax的表達;(5)Western blot檢測正常組與高胰島素組小鼠孕D6、D7、D8,假孕PD6、PD8和人工誘導蛻膜化小鼠蛻膜側(cè)子宮凋亡相關基因的表達。3.PI3K/Akt信號通路可能參與高水平胰島素對子宮內(nèi)膜細胞凋亡的影響:(1)Western blot檢測子宮內(nèi)膜PI3K/Akt信號通路相關蛋白以及凋亡相關蛋白的表達;(2)正常組與高胰島素組小鼠子宮宮角注射PI3K/Akt信號通路特異抑制劑LY294002后,進一步分析PI3K/Akt信號通路是否參與高水平胰島素對子宮內(nèi)膜細胞凋亡的影響。4.原代分離培養(yǎng)小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞并體外誘導蛻膜化:小鼠子宮內(nèi)膜組織分離提取基質(zhì)細胞進行培養(yǎng),免疫熒光檢測Vimentin進行基質(zhì)細胞純度鑒定。利用雌、孕激素對正常組與高胰島素組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞進行體外誘導蛻膜化,RT-PCR檢測蛻膜化標志分子dtprp的表達。5.高水平胰島素對小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化后凋亡以及蛻膜化的影響:(1)高胰島素組和正常組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化后,采用流式細胞術(shù)和TUNEL的方法檢測細胞的凋亡;(2)JC-1檢測小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化后細胞色素C的釋放;(3)高胰島素組和正常組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化后,Western blot檢測PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達,以及凋亡和蛻膜化相關蛋白的表達;(4)加入PI3K/Akt信號通路特異抑制劑LY294002后,進一步分析PI3K/Akt信號通路是否參與高水平胰島素對小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化后凋亡以及蛻膜化的影響。結(jié)果:1.高水平胰島素小鼠模型的建立:早孕小鼠斷頸處死前,尾靜脈血測血糖結(jié)果顯示高胰島素組小鼠血糖明顯升高;ELISA結(jié)果顯示高胰島素組孕鼠血清中胰島素水平明顯升高。2.高水平胰島素對小鼠子宮內(nèi)膜凋亡的影響:流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示高胰島素組子宮內(nèi)膜細胞凋亡水平顯著降低;透射電鏡結(jié)果顯示高水平胰島素組子宮內(nèi)膜細胞凋亡小體明顯減少;Bax的RT-PCR結(jié)果和Bax的免疫組化結(jié)果一致,顯示高胰島素組子宮內(nèi)膜Bax表達明顯下降;Western blot結(jié)果顯示高胰島素組Bax、cleaved-Casepase3、cleaved-PARP表達顯著降低而Bcl2表達明顯升高。3.PI3K/Akt信號通路可能參與高水平胰島素對子宮內(nèi)膜細胞凋亡的影響:Western blot的結(jié)果顯示在高胰島素組中,小鼠子宮內(nèi)膜PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達明顯改變。然而,抑制劑LY294002能夠顯著恢復高水平胰島素對早孕小鼠子宮內(nèi)膜細胞PI3K/Akt信號通路相關蛋白的影響。4.高水平胰島素對小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化后凋亡的影響:高胰島素組和正常組小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化后,流式細胞術(shù)、TUNEL、JC-1以及Western blot檢測結(jié)果顯示高胰島素組凋亡水平顯著降低。然而,抑制劑LY294002能夠改善高水平胰島素對原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化后凋亡的影響。5.高水平胰島素對小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化的影響:RT-PCR結(jié)果顯示在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外誘導蛻膜化模型中,高胰島素組蛻膜化相關因子dtptp表達明顯降低。同時,Western blot的結(jié)果顯示蛻膜化相關蛋白在高胰島素組中受到明顯抑制,表明高胰島素組子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞體外蛻膜化受到顯著影響。然而,抑制劑LY294002能夠顯著改善高水平胰島素對原代培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞蛻膜化后的影響。結(jié)論:研究表明高水平胰島素可能打破子宮內(nèi)膜細胞凋亡的平衡進而影響子宮內(nèi)膜蛻膜化,PI3K/Akt信號通路可能參與其中。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.2

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本文編號：2420812