【摘要】：目的:通過調控免疫炎癥通路LPS-TLR4-NF-κB上跨膜蛋白TLR4和核轉錄因子NF-κB的表達,并對孕期和產后LPS-TLR4-NF-κB通路表達進行觀察,研究免疫炎癥與GDM發(fā)生發(fā)展的關系。方法:1.抽取20例正常孕婦晨起靜脈血15ml,采用Ficoll-hypaque密度梯度離心法獲得外周靜脈血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),并在培養(yǎng)4h、24h、48h、72h時,用counstar(IC1000)細胞計數(shù)儀分別計數(shù)培養(yǎng)液中PMBC的細胞總濃度、活細胞濃度、死細胞濃度、細胞的活率、細胞的平均直徑、細胞平均圓度以及細胞平均結團率,使用重復測量數(shù)據(jù)方差分析比較不同時間點各數(shù)據(jù)的差異。對培養(yǎng)液中的LPS及炎癥因子和TNF-α的水平分別選擇血清中、培養(yǎng)前、培養(yǎng)后以及培養(yǎng)后+LPS四點進行檢測,采用t檢驗來比較不同時段培養(yǎng)板中炎癥因子的濃度;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的檢測采用鱟試劑顯色基質法,TNF-α的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent Assay,ELISA)。2.納入GDM組和對照組孕婦各30例,抽取晨起靜脈血15ml,留血清后取PMBC培養(yǎng)48h,檢測血清中LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR數(shù)值,檢測培養(yǎng)后兩組TLR4乙�；磉_、NF-κB表達、以及TNF-α水平。GDM組培養(yǎng)后按照未加試劑、加入LPS、加入LPS+MBL、加入LPS+PDTC分別再培養(yǎng)24h,分別檢測TLR4表達、NF-κB表達、以及TNF-α水平。采用t檢驗比較GDM組與對照組血清中LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR數(shù)值;同時比較培養(yǎng)后乙�；疶LR4表達、NF-κB表達、以及TNF-α水平;采用單因素方差分析和SNK-Q檢驗的方法對GDM組中未加試劑組、LPS組、LPS+MBL組、LPS+PDTC組中TLR4乙�；磉_、NF-κB表達、以及TNF-α水平進行兩兩比較;采用Pearson相關分析對LPS組、LPS+MBL組、LPS+PDTC組中TLR乙�；�4表達、NF-κB表達與TNF-α的水平的相關性進行比較。采用鱟試劑顯色基質(微板法)檢測培養(yǎng)液中LPS的水平;采用免疫沉淀法(Immunoprecipitation,IP)和蛋白質免疫印跡(Western blot,WB)法檢測TLR4乙�；谋磉_;采用Western blot法檢測NF-κB(主要為NF-κB-P65)的表達;培養(yǎng)上清液中TNF-α的水平采用ELISA法檢測。3.入選GDM與正常孕婦各20例,在孕期(孕24-28周)及產后42天后分別抽取晨起靜脈血15ml。檢測血清中LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR數(shù)值,同時對所獲得PMBC培養(yǎng)48h,分別檢測培養(yǎng)后以及培養(yǎng)后加入LPS時的TLR4表達乙�；�、NF-κB表達、以及TNF-α水平,并采用單因素方差分析和SNK-Q檢驗的方法分別對培養(yǎng)后以及培養(yǎng)后加入LPS時的TLR4表達乙�；�、NF-κB表達、以及TNF-α水平進行兩兩比較;TLR4乙�；谋磉_與NF-κB的表達采用IP及WB法檢測;培養(yǎng)上清液中TNF-α的水平采用ELISA法檢測。結果:1.隨著PMBC培養(yǎng)時間的增加,細胞總濃度不斷增加,活細胞濃度和細胞的活率逐漸下降,死細胞濃度和細胞平均結團率逐漸上升,差異有統(tǒng)計學意義(F值見表3,P0.05);細胞的平均直徑、細胞平均圓度在各個培養(yǎng)時間點的數(shù)值進行比較,各個時間點并沒有明顯差別(P0.05),本研究認為合適的培養(yǎng)時間為48h。2.LPS僅在血清中能測出,TNF-α的水平在不同的時間段從高到底依次為在培養(yǎng)后+LPS時、血清中、培養(yǎng)后、培養(yǎng)前,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.對照組與GDM孕婦在年齡、孕周上的差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。,GDM組血清中LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR數(shù)值均高于正常孕婦組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),體外培養(yǎng)后GDM組TLR4乙�；磉_、NF-κB表達、以及TNF-α水平亦均高于正常孕婦組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.GDM孕婦PMBC細胞體外培養(yǎng)后LPS組、LPS+MBL組以及LPS+PDTC組中TLR4乙�；谋磉_均高于未加試劑組,LPS組與LPS+PDTC組TLR4乙�；谋磉_高于LPS+MBL組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);LPS組與LPS+PDTC組相比,TLR4乙�；谋磉_沒有區(qū)別,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05);LPS組NF-κB的表達高于LPS+MBL組、LPS+PDTC組和未加試劑組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);LPS+MBL組、LPS+PDTC組與未加試劑組之間NF-κB的表達沒有差別,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。LPS組TNF-α的水平高于LPS+MBL組、LPS+PDTC組和未加試劑組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);LPS+MBL組、LPS+PDTC組與未加試劑組之間TNF-α的水平沒有差別,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.在LPS組,TLR4表達、NF-κB表達與TNF-α的水平均相關,(P0.05);在LPS+MBL組,TLR4表達、NF-κB表達與TNF-α的水平均相關,(P0.05);在LPS+PDTC組,TLR4表達與NF-κB表達、TNF-α的水平不相關,(P0.05),NF-κB表達與TNF-α的水平相關(P0.05)。6.GDM孕期組血清LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR數(shù)值分別高于GDM產后組、正常孕期組和正常產后組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);GDM產后組、正常孕期組和正常產后組三組間血清LPS水平、TNF-α水平以及HOMA-IR數(shù)值的比較沒有差別,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。四組PMBC培養(yǎng)后,GDM孕期組TLR4乙�；磉_、NF-κB表達、以及TNF-α水平分別高于其它三組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);GDM產后組、正常孕期組和正常產后組三組間TLR4乙�；磉_、NF-κB表達、以及TNF-α水平比較沒有差別,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。四組PMBC培養(yǎng)并加入LPS后,GDM孕期組TLR4乙�；磉_、NF-κB表達、以及TNF-α水平分別高于其它三組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);GDM產后組TLR4乙�；磉_、NF-κB表達、以及TNF-α水平分別高于正常孕期組和正常產后組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);正常孕期組和正常產后組TLR4乙酰化表達、NF-κB表達、以及TNF-α水平比較沒有差別,差異沒有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:利用Ficoll-hypaque密度梯度離心法獲取PMBC,經過體外培養(yǎng)后,可以構建LPS誘導的PMBC免疫炎癥體外模型。GDM孕婦體內LPS-TLR4-NF-κB通路處于活化狀態(tài),可以通過調控LPS-TLR4-NF-κB通路中跨膜蛋白TLR4與核轉錄因子NF-κB活性的來調控通路下游TNF-α的水平,進而影響IR,參與GDM的發(fā)生發(fā)展。GDM孕婦產后LPS-TLR4-NF-κB通路在不同條件下的變化為GDM是“一過性炎癥”狀態(tài)提供依據(jù),并可能與將來發(fā)生2型糖尿病相關。
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【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.256

【參考文獻】

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本文編號：2415042