發(fā)布時間：2019-01-14 13:24

【摘要】：研究目的 在臨床腫瘤治療過程中，腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性的下降直至耐藥是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因。近年來，雖然鉑類藥物和紫杉醇的聯(lián)合應(yīng)用，使得卵巢癌患者的五年生存率有所升高，但最終不可避免發(fā)生的化療耐藥（特別對鉑類耐藥）成為影響患者的生存期的關(guān)鍵因素。腫瘤耐藥的原因仍不太清楚，但增加化療的敏感性一方面可以減少藥物的毒性作用，提高療效，另一方面可能減少耐藥的發(fā)生率。本課題通過研究不同濃度的順鉑（DDP）對卵巢癌細(xì)胞α2，3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（ST3GalⅢ）表達(dá)的影響，以及卵巢癌細(xì)胞的不同ST3GalⅢ水平對DDP毒性的耐受作用和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)的差異，探討唾液酸轉(zhuǎn)移酶抑制劑(ST3GalⅢ-siRNA)聯(lián)合DDP是否增強卵巢癌細(xì)胞化療敏感性，為卵巢癌的臨床治療提供新的思路。 研究方法 1.鑒定不同卵巢癌細(xì)胞株ST3GalⅢ表達(dá)水平的差異：用qRT-PCR檢測及比較4個卵巢癌細(xì)胞株（OVCAR3、SKOV3、HO8910、HO8910PM），ST3GalⅢ mRNA的表達(dá)水平。篩選出ST3GalⅢ高表達(dá)細(xì)胞株(HO8910PM)及低表達(dá)細(xì)胞株(SKOV3)用于進一步實驗。 2.確定DDP對卵巢癌細(xì)胞的半數(shù)抑制率：MTT法分別檢測DDP對卵巢癌ST3GalⅢ高、低表達(dá)細(xì)胞株(HO8910PM、SKOV3)增殖抑制率的影響，計算IC50值，初步比較不同ST3GalⅢ水平的卵巢癌細(xì)胞株對DDP的化療敏感性。 3.確定DDP對低表達(dá)ST3GalⅢ卵巢癌細(xì)胞的作用濃度和時間：選擇低表達(dá)ST3GalⅢ的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，分別通過不同DDP濃度（0μmol/L、1μmol/L、20μmol/L、100μmol/L），不同的作用時間（24h、48h、72h），qRT-PCR檢測各組細(xì)胞的ST3GalⅢ mRNA表達(dá)，探究DDP對卵巢癌細(xì)胞ST3GalⅢ的表達(dá)的影響，篩選出DDP的最佳作用濃度及最佳作用時間。 4.觀察siRNA對卵巢癌HO8910PM細(xì)胞ST3GalⅢ-mRNA（高表達(dá)）的選擇性敲減作用：選擇高表達(dá)ST3GalⅢ的卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染ST3GalⅢ-siRNA（序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）48h后，通過qRT-PCR和Western blot評價siRNA對細(xì)胞ST3GalⅢ的表達(dá)抑制效率，探究ST3GalⅢ-siRNA的有效性并篩選出最有效的序列片段。 5.低表達(dá)ST3GalⅢ的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，先后經(jīng)DDP處理和ST3GalⅢ-siRNA轉(zhuǎn)染，用Western blot法檢測不同ST3GalⅢ表達(dá)水平的卵巢癌細(xì)胞CAS凋亡蛋白caspase8及caspase3表達(dá)量的改變，用FACS、TUNEL法等分析細(xì)胞凋亡效應(yīng)的改變，探討在SKOV3中不同ST3GalⅢ水平對DDP化療效果的影響。 6.高表達(dá)ST3GalⅢ的卵巢癌HO8910PM細(xì)胞，用siRNA下調(diào)其ST3GalⅢ表達(dá)后，聯(lián)合應(yīng)用DDP，用Western blot法檢測不同ST3GalⅢ水平細(xì)胞CAS凋亡蛋白caspase8及caspase3表達(dá)量的改變，F(xiàn)ACS、TUNEL法等分析細(xì)胞凋亡效應(yīng)的改變，探討在HO8910PM細(xì)胞中不同ST3GalⅢ水平對DDP化療效果的影響。 結(jié)果 1.不同卵巢癌細(xì)胞株ST3GalⅢ mRNA的表達(dá)有明顯差異：通過qRT-PCR檢測結(jié)果證實ST3GalⅢ mRNA在4個卵巢癌細(xì)胞株（OVCAR3、SKOV3、HO8910、HO8910PM）中存在差異表達(dá)（P＜0.01）；其中HO8910PM ST3GalⅢ mRNA的表達(dá)水平最高，SKOV3的表達(dá)水平最低，因此本實驗選擇HO8910PM、SKOV3兩細(xì)胞株進行后續(xù)實驗。 2.確定了DDP對SKOV3和HO8910PM細(xì)胞增殖抑制的適宜濃度：通過MTT法檢測不同濃度DDP作用24h SKOV3和HO8910PM細(xì)胞的增殖抑制率，證實SKOV3細(xì)胞的增殖抑制率明顯比HO8910PM高（P＜0.05），SKOV3的IC50值為69.29±1.46μmol/L，HO8910PM的IC50值為425.77±6.58μmol/L；選擇三個DDP濃度1μmol/L、20μmol/L、100μmol/L進行后續(xù)實驗。 3. DDP在低濃度下對ST3GalⅢ的表達(dá)有增強誘導(dǎo)作用：通過qRT-PCR檢測結(jié)果證實ST3GalⅢ對DDP具有一定的劑量和時間依賴性，而1μmol/L DDP作用不同時間可不同程度地上調(diào)ST3GalⅢ的表達(dá)，以1μmol/L DDP作用48h時，其ST3GalⅢ mRNA表達(dá)水平升高更為顯著，表達(dá)量約為對照組的2.5倍，確定DDP的最佳作用濃度為1μmol/L，，最佳作用時間是48h。 4. siRNA特異性抑制卵巢癌細(xì)胞ST3GalⅢ的表達(dá)：經(jīng)ST3GalⅢ-siRNA轉(zhuǎn)染48h后，siRNA序列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ處理組的ST3GalⅢ mRNA表達(dá)量分別為Control組的14.4%、27.4%、35.2%，均比Control組、Lipo組、NC組、 PC組低，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），其中siRNAⅠ組ST3GalⅢ mRNA表達(dá)量最低；Western bolt結(jié)果也證實siRNAⅠ能有效抑制ST3GalⅢ蛋白的表達(dá)，選擇siRNAⅠ序列進行后續(xù)轉(zhuǎn)染實驗。 5.卵巢癌SKOV3細(xì)胞經(jīng)DDP+siRNA處理CAS凋亡蛋白的表達(dá)增強，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加：Western bolt檢測結(jié)果顯示，1μmol/L DDP作用48h后（DDP組）ST3GalⅢ的表達(dá)上調(diào)；先后經(jīng)DDP處理-siRNA轉(zhuǎn)染的(DDP+siRNA)組ST3GalⅢ的表達(dá)被顯著下調(diào)，而其caspase8、caspase3的表達(dá)量也隨之升高；其相應(yīng)的對照組（DDP+Lipo組、DDP+NC組、DDP+Control組）ST3GalⅢ、caspase8、caspase3的表達(dá)量無明顯增加。同樣FACS法和TUNEL法檢測也顯示（DDP+siRNA）組與其他各組比較，凋亡率顯著增加。 6.卵巢癌HO8910PM細(xì)胞經(jīng)siRNA+DDP處理CAS凋亡蛋白的表達(dá)增強，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加：Western bolt檢測結(jié)果顯示，經(jīng)1μmol/L DDP作用48h后（DDP組），HO8910PM細(xì)胞的ST3GalⅢ未被上調(diào)，其caspase8、caspase3的表達(dá)量與Control組比較也未見增加，但經(jīng)siRNA沉默ST3GalⅢ的表達(dá)后，再聯(lián)用DDP（siRNA+DDP組），其caspase8、caspase3的表達(dá)量顯著增加，而其相應(yīng)的對照組（siRNA、Lipo+DDP組、NC+DDP組）caspase8、caspase3的表達(dá)并未增加。同樣FACS法和TUNEL法檢測也顯示（siRNA+DDP）組與其他各組比較，凋亡率顯著增加。 結(jié)論 1.四株卵巢癌細(xì)胞（HO8910PM、HO8910、SKOV3、OVCAR3）ST3GalⅢ的表達(dá)有顯著差異，其中HO8910PM ST3GalⅢ的表達(dá)水平最高，SKOV3的表達(dá)水平最低。 2. ST3GalⅢ的高表達(dá)增強卵巢癌細(xì)胞對DDP的耐受，細(xì)胞增殖抑制率下降。 3.適宜濃度（1μmol/L）及適宜時間（24h、48h、72h）作用下DDP可以上調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞ST3GalⅢ的表達(dá)，而以1μmol/L DDP作用48h其ST3GalⅢ上調(diào)作用更顯著。 4. ST3GalⅢ-siRNA可以有效下調(diào)卵巢癌細(xì)胞ST3GalⅢ的表達(dá)。 5. siRNA下調(diào)ST3GalⅢ的表達(dá)可以增加DDP對卵巢癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。 6. ST3GalⅢ-siRNA可以通過caspase途徑促進卵巢癌細(xì)胞對DDP的凋亡效應(yīng)。 7. ST3GalⅢ-siRNA聯(lián)合DDP作用可以提高卵巢癌細(xì)胞對DDP的化療敏感性。
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【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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2 倪型灝,許沈華,張谷,錢麗娟,高永良;高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細(xì)胞系及其母系多基因表達(dá)研究[J];實用癌癥雜志;1999年01期

本文編號：2408734