【摘要】：研究背景 卵巢上皮癌(epithelial ovarian cancer, EOC)的病死率高居婦科惡性腫瘤之首,晚期患者的5年生存率僅約30%。目前,腫瘤細胞減滅術聯(lián)合鉑類藥物為基礎的化療,對約70%的晚期患者初期治療有效,但大部分患者最終會出現(xiàn)化療耐藥導致疾病復發(fā)。因此,深入認識EOC的進展機制,有效改善EOC的不良預后是目前臨床亟待解決的難題。 新近的研究發(fā)現(xiàn),EOC化療耐藥與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)密切相關。EMT是指上皮細胞表面黏附分子表達降低、細胞間連接變得疏松、細胞骨架重塑,轉(zhuǎn)變成間充質(zhì)細胞表型過程。已有的研究證實EMT在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥中具有重要的調(diào)控作用。更重要的是,有研究發(fā)現(xiàn)EOC中存在的腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)具有EMT的特征。CSCs學說認為：腫瘤是由異質(zhì)性的細胞群體構成；其中存在極少量具有干細胞性質(zhì)的癌細胞亞群,是腫瘤發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移及耐藥性產(chǎn)生的根源。因此,抑制EMT可能成為有效改善EOC預后的策略。 微小RNA(microRNA, miRNA, miR)是一類非編碼的單鏈小分子RNA,長度約18-24個核苷酸(nucleotide, nt),其通過與mRNA3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region,3'-UTR)堿基識別配對,調(diào)控靶基因的表達。目前已發(fā)現(xiàn)miRNAs在調(diào)控EMT中具有重要作用,亦與多種腫瘤的發(fā)生及進展關系密切。Yang,等分析了459例EOC腫瘤組織的mRNA及miRNAs表達譜特征,證實間充質(zhì)表型與EOC的不良預后相關,包括miR-20a、miR-141和miR-506在內(nèi)的8個關鍵miRNA,調(diào)控了高達89%的間充質(zhì)相關基因表達。 miR-200a和miR-141同屬于miR-200家族(miR-200s,包括miR-200a/b/c/和miR-141/429共5個miRNA)。近年的研究發(fā)現(xiàn)miR-200s在多種腫瘤中具有阻礙EMT進程、抑制CSCs自我更新和去分化狀態(tài)、調(diào)控細胞增殖及凋亡、逆轉(zhuǎn)化療耐藥的作用。在EOC中已證實miR-200s的表達水平與化療敏感性、無進展生存期(progression-free survival, PFS)以及總生存期(overall survival, OS)呈正相關。這些研究結(jié)果說明以miR-200s作為EOC潛在的治療策略,具有理論上的可行性和積極的臨床意義。 有研究證實,在EOC細胞株Hey中,過表達miR-200c通過靶向調(diào)控TUBB3增加了紫杉醇的敏感性。我們前期在卵巢漿液性腺癌細胞系--OVCAR-3中驗證了CD133+細胞具有CSCs特征；進一步用miRNA芯片發(fā)現(xiàn)CD133+與CD133-細胞間存在miRNAs的差異表達譜；其中miR-200a在CD133+細胞中下調(diào)了約2.16倍,利用合成的miR-200a模擬物—miR-200a mimics,在CD133±細胞中瞬時上調(diào)miR-200a水平,發(fā)現(xiàn)miR-200a通過靶向下調(diào)ZEB2抑制了CD133+細胞的遷移和侵襲能力,初步證實miR-200a在EOC中具有抑制轉(zhuǎn)移的積極作用。但目前關于miR-200a對EOC化療敏感性和CSCs的調(diào)控作用及其相關機制尚未完全闡明。 我們發(fā)現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染,miR-200a mimics的方法僅適用于短期內(nèi)觀察,miR-200a對EOC細胞的影響；并且分選得到的CD133+細胞所占比例非常低(約0.2-1%)；另外,CD133+細胞在體外培養(yǎng)過程中逐漸分化為CD133-細胞的問題,都將為我們深入探索miR-200a在EOC中的生物學功能帶來一定的局限性。近來,Wang,等用基因芯片鑒定了無血清培養(yǎng)OVCAR-3所形成的懸浮生長細胞球,具有CSCs的特征,適宜作為研究EOC中CSCs的體外模型。 綜合考慮上述因素,本課題首先利用慢病毒表達載體成功構建了穩(wěn)定上調(diào)miR-200a的EOC細胞模型,在普通貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)條件下,驗證了miR-200a對EOC化療敏感性的影響；進一步探索了miR-200a調(diào)控EOC增殖狀態(tài)和CSCs的作用及其機制,以期為改善EOC的預后帶來更新更有力的治療策略。 第一章構建穩(wěn)定高表達miR-200a的EOC細胞模型 目的： 利用慢病毒表達載體,構建穩(wěn)定高表達miR-200a的貼壁及懸浮生長EOC細胞模型,為深入探索miR-200a對EOC的生物學作用及其機制提供平臺。 方法： 1. miR-200a過表達慢病毒載體和對照空載體的鑒定。 miR-200a過表達慢病毒載體pLV-miR-200a和對照空載體pLV-control購自深圳市華安平康生物科技有限公司。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒擴增、質(zhì)粒提取、PCR擴增、DNA電泳以及DNA測序,鑒定miR-200a慢病毒表達載體和對照空載體。 2. miR-200a過表達慢病毒和對照慢病毒的包裝。 慢病毒包裝元件psPAX2和pMD2.G由南方醫(yī)科大學腫瘤研究所提供,pLV-miR-200a或pLV-control、psPAX2和pMD2.G共同組成慢病毒包裝系統(tǒng)。用Lipofectamine2000將慢病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝生產(chǎn)攜帶miR-200a過表達的慢病毒和對照慢病毒。 3. miR-200a過表達慢病毒和對照慢病毒感染EOC細胞。 用攜帶]miR-200a過表達的慢病毒和對照慢病毒,分別感染EOC細胞株OVCAR-3,在倒置熒光顯微鏡下觀察報告基因一綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)的表達,以監(jiān)測感染效率,應用流式細胞儀分選GFP+細胞。 4.驗證miR-200a在感染后EOC細胞中的表達水平。 提取經(jīng)流氏細胞儀分選后EOC細胞的總RNA, qRT-PCR檢測miR-200a的表達水平,大量擴增并凍存高表達miR-200a的EOC細胞和對照細胞,用于后續(xù)實驗。 5.建立miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞模型。 收集過表達miR-200a的貼壁生長EOC細胞和對照組細胞,分別用PBS洗滌2次,重懸于腫瘤球培養(yǎng)基(含EGF20ng/mL、bFGF10ng/mL、0.4%BSA、 insulin5μg/mL、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM/F12),接種于超低吸附培養(yǎng)皿,常規(guī)條件培養(yǎng),間隔72h添加適量腫瘤球培養(yǎng)基,7d后收集球體細胞,用0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶1：1混合液消化球體細胞,繼續(xù)用上述方法傳代培養(yǎng),得到懸浮生長的EOC細胞。qRT-PCR檢測懸浮生長的EOC細胞中miR-200a的表達水平。 6.利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理,采用單樣本t檢驗分析貼壁及懸浮生長EOC細胞中miR-200a的表達差異,顯著性水平定義α=0.05,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,數(shù)據(jù)用“均數(shù)士標準差”表示。 結(jié)果： 1.DNA測序證實miR-200a過表達慢病毒載體和對照空載體序列均正確。 2.成功生產(chǎn)了miR-200a過表達慢病毒和對照慢病毒,用以感染EOC細胞株OVCAR-3,感染后在倒置熒光顯微鏡下可見GFP十細胞的表達率約為20%-30%,進一步用流式細胞儀分選GFP+細胞,得到感染效率約為95%的EOC細胞。 3.成功構建了miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞模型。qRT-PCR驗證攜帶miR-200a轉(zhuǎn)基因的貼壁生長EOC細胞與對照細胞相比,miR-200a的表達水平升高(3.67±0.45)倍。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,攜帶miR-200a轉(zhuǎn)基因的貼壁生長EOC細胞和對照細胞,miR-200a的表達差異具有統(tǒng)計學意義(t值=10.187,P=0.009)。 4.成功構建miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞模型。qRT-PCR驗證攜帶miR-200a轉(zhuǎn)基因的懸浮生長EOC細胞與對照細胞相比,miR-200a的表達水平升高(2.05±0.39)倍。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,攜帶miR-200a轉(zhuǎn)基因的懸浮生長EOC細胞和對照細胞,niR-200a的表達差異具有統(tǒng)計學意義(t值=4.666,P=0.043)。 結(jié)論： 成功將目的基因miR-200a整合入EOC細胞中并實現(xiàn)高效表達,建立了穩(wěn)定過表達miR-200a的貼壁及懸浮生長EOC細胞模型。 第二章MiR-200a對EOC化療敏感性、增殖及CSCs的調(diào)控作用及其機制 第一節(jié)MiR-200a對EOC化療敏感性的調(diào)控作用 目的： 在穩(wěn)定過表達miR-200a的貼壁及懸浮生長EOC細胞模型中,驗證miR-200a對EOC化療敏感性的調(diào)控作用。 方法： 1.MTT檢測miR-200a;對貼壁生長EOC細胞化療敏感性的影響。 收集miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞和對照細胞,分別重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。按5x103細胞／孔接種于普通96孔板內(nèi),培養(yǎng)12-16h后,在細胞中分別加入不同濃度的紫杉醇(終濃度分別為：2nM,4nM,8nM,16nM,32nM)或順鉑(終濃度分別為：lug/mL,2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL),每個濃度設4個重復孔。藥物作用48h后,每孔中加入201μL細胞活力檢測試劑MTT(5mg/mL),繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h后,小心棄去細胞上清液,每孔分別加入100uL DMSO,避光震蕩混勻后,置酶聯(lián)檢測儀上測定各孔光密度(OD)值,檢測波長490nm。細胞存活率(SR)按以下公式計算：加藥孔吸光度平均值／空白對照組吸光度平均值x100%。實驗重復三次。 2.MTT檢測miR-200a;對懸浮生長EOC細胞化療敏感性的影響。 收集miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞和對照細胞,分別重懸于腫瘤球培養(yǎng)基,按1x104細胞／孔接種于超低吸附96孔板內(nèi),培養(yǎng)24h后,在細胞中分別加入不同濃度紫杉醇(終濃度分別為：2nM,8nM,32nM,128nM,512nM)或順鉑(終濃度分別為：2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL),每個濃度設4個重復孔。藥物作用72h后,每孔中加入20μL細胞活力檢測試劑MTT(5mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4h后,箱式離心機3000rpm離心15min,此時可見腫瘤球細胞聚集于孔板的一側(cè),用1mL注射器小心吸棄上清液,每孔分別加入100uLDMSO,避光震蕩混勻后,置酶聯(lián)檢測儀上測定各孔光密度(OD)值,檢測波長490nm。細胞存活率(SR)按以下公式計算：加藥孔吸光度平均值/空白對照組吸光度平均值x100%。實驗重復三次。 3.利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理,采用析因設計的方差分析和兩個獨立樣本的t檢驗,分析細胞毒性試驗中細胞存活率之間的差異。P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,數(shù)據(jù)用“均數(shù)士標準差”表示。 結(jié)果： 1. miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞和對照組細胞,在紫杉醇的終濃度為：2nM,4nM,8nM,16nM,32nM時,細胞存活率(%)分別為：(85.86±4.16vs.87.80±2.22),(74.66±3.19vs.80.62±2.60),(65.85±4.24vs.76.15±4.46),(54.91±4.43vs.69.53±3.31),(54.62±1.76vs.66.91±3.41)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞與對照組細胞,紫杉醇細胞毒性之間的差異總體有統(tǒng)計學意義(F值=63.464,P值0.001)。 miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞和對照組細胞,在順鉑的終濃度為：1ug/mL,2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mLL時,細胞存活率(%)分別為：(90.24±5.00vs.85.60±3.60),(66.96±3.57vs.71.95±6.68),(62.02±2.57vs.66.46±2.89),(54.45±2.63vs.56.89±2.80),(49.39±4.21vs.46.61±2.75),(43.54±4.34vs.42.38±2.18)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞與對照組細胞,順鉑細胞毒性之間的差異總體沒有統(tǒng)計學意義(F值=0.247,P值=0.622)。 2. miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞和對照組細胞,在紫杉醇的終濃度為：2nM,8nM,32nM,128nM,512nM時,細胞存活率(%)分別為：(69.27±3.63vs.83.43±4.01),(57.03±2.88vs.78.91±0.86),(57.47±1.31vs.80.89±1.29),(57.69±1.35vs.80.11±1.80),(55.17±0.60vs.77.96±3.75)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞與對照組細胞,紫杉醇細胞毒性之間的差異總體有統(tǒng)計學意義(F值=721.813,P值0.001)。 miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞和對照組細胞,在順鉑的終濃度為：2ug/mL,4ug/mL,8ug/mL,16ug/mL,32ug/mL時,細胞存活率(%)分別為：(50.80±2.35vs.54.37±1.86),(42.64±2.80vs.41.71±1.62),(49.66±2.03vs.46.92±6.37),(46.84±7.72vs.51.57±5.25),(42.66±2.98vs.45.54±5.36)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞與對照組細胞,順鉑細胞毒性之間的差異總體沒有統(tǒng)計學意義(F值=1.191,P值=0.284)。 結(jié)論： miR-200a過表達增加了貼壁和懸浮生長的EOC細胞對紫杉醇的敏感性,沒有影響貼壁和懸浮生長的EOC細胞對順鉑的敏感性。 第二節(jié)MiR-200a對EOC細胞增殖狀態(tài)的調(diào)控作用 目的： miR-200a具有提高貼壁和懸浮生長的EOC細胞對紫杉醇敏感性的作用,而對順鉑的敏感性沒有影響；考慮到紫杉醇是靶向細胞增殖周期的藥物,而順鉑為非細胞周期依賴藥物,所以有必要進一步探索miR-200a對EOC細胞增殖狀態(tài)的影響。本部分通過一系列體內(nèi)、外實驗驗證了miR-200a對EOC細胞增殖狀態(tài)的調(diào)控作用。 方法： 1.平板克隆形成實驗檢測]miR-200a;對貼壁生長EOC細胞增殖狀態(tài)的影響。 收集lniR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞和對照細胞,重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基,按1.5x102細胞/孔接種于普通6孔板內(nèi),每組設3個復孔,常規(guī)培養(yǎng)10d,觀察細胞克隆的形態(tài),計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù),棄掉培基,PBS小心漂洗3遍,甲醇固定10min,蘇木素染色5-10min,自來水小心漂洗后,拍照記錄克隆外觀。計算克隆形成率=(克隆數(shù)／接種細胞數(shù))x100%。 2.生長曲線(CCK8法)實驗檢測]miR-200a對貼壁及懸浮生長EOC細胞增殖狀態(tài)的影響。 收集miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞和對照細胞,重懸于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基,按2.0×103細胞／孔接種于普通96孔培養(yǎng)板中,每組設6個復孔,培養(yǎng)6h、1、2、3、4、5、6d時,加入CCK8與培基混合液110μL(比例為1：10),繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)1.5h,以空白對照孔調(diào)零,置酶聯(lián)檢測儀上測定各孔光密度(OD)值,檢測波長450nm,以相對應OD值代表細胞增殖狀態(tài),各組取6孔OD值的平均值,繪制細胞增殖曲線。 收集miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞和對照細胞,重懸于腫瘤球培養(yǎng)基,按4.0×103細胞／孔接種于超低吸附96孔培養(yǎng)板中,每組設6個復孔,培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d時,加入CCK8液10μL,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4h,以空白對照孔調(diào)零,置酶聯(lián)檢測儀上測定各孔光密度(OD)值,檢測波長450nm,以相對應OD值代表細胞增殖狀態(tài),各組取6孔OD值的平均值,繪制細胞增殖曲線。 3.流式細胞儀檢測miR-200對貼壁及懸浮生長EOC細胞細胞周期分布的影響。 分別收集]miR-200a過表達及對照的貼壁和懸浮生長EOC細胞,用預冷PBS漂洗細胞兩次,加入預冷70%乙醇,4℃固定過夜或-20℃長期固定,檢測前PBS漂洗細胞一次,加入含50μg/mL溴化乙錠(PI)、100μg/mL RNase A、0.2%TritonX-100的PBS500μL,室溫避光孵育30分鐘,以標準程序用流式細胞儀檢測,計數(shù)1～2萬個細胞,結(jié)果用細胞周期擬和軟件ModFit分析結(jié)果。 4.體內(nèi)驗證miR-200a對EOC細胞增殖狀態(tài)的影響。 選取4-5周齡雌性BALB/c-nu/nu裸鼠作為實驗對象,將miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞和對照組細胞,分別皮下注射移植入裸鼠背部的右側(cè)及左側(cè),每側(cè)移植1.5x106個細胞,細胞懸液總體積為100μL。實驗共用8只裸鼠,每3日觀察裸鼠一般情況、測量接種部位包塊生長情況并記錄裸鼠體重,依據(jù)移植瘤生長情況適時取材并作相關分析。 5.取移植瘤組織免疫組化檢測Ki67的表達情況,光學顯微鏡下觀察拍照,隨機選取3個高倍視野,計算每個視野陽性細胞比例。陽性細胞比例=每個視野下陽性細胞數(shù)/每個視野下細胞總數(shù)×100%。 6.利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理,采用兩個獨立樣本t檢驗分析平板克隆形成率差異、移植瘤組織中Ki67陽性率差異、細胞周期分布差異。采用析因設計的方差分析,分析生長曲線(CCK8法)及裸鼠皮下移植瘤生長差異,P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,數(shù)據(jù)用“均數(shù)士標準差”表示。 結(jié)果： 1.平板克隆實驗中,miR-200過表達的貼壁生長EOC細胞較對照組細胞,體積縮小、細胞排列更緊密,更傾向于上皮細胞表型；miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞與對照組細胞的克隆形成率(%)分別為(92.52±5.60vs.79.12±4.41)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞與對照組細胞,克隆形成率的差異具有統(tǒng)計學意義(t值=-4.461,P值=0.001)。 2.生長曲線(CCK8法)實驗中,miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞和對照組細胞,在培養(yǎng)8h、1、2、3、4、5、6d時,吸光度值(OD)分別為(0.278±0.008vs.0.275±0.002),(0.500±0.096vs.0.433±0.035),(0.624±0.058vs.0.528±0.046),(1.028±0.115vs.0.710±0.048),(1.530±0.160vs.1.000±0.171),(1.993±0.206vs.1.239±0.159),(2.450±0.233vs.1.428±0.161)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞與對照組細胞,細胞增殖的差異總體具有統(tǒng)計學意義(F值=199.507,P值0.001)。 miR-200過表達的懸浮生長EOC細胞和對照組細胞,在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d時,吸光度值(OD)分別為(0.218±0.015vs.0.216±0.013),(0.333±0.013vs.0.323±0.014),(0.462±0.028vs.0.437±0.021),(0.720±0.078vs.0.565±0.050),(0.952±0.081vs.0.688±0.062),(1.149±0.116vs.0.803±0.054),(1.434±0.135vs.0.957±0.080)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞與對照組細胞,細胞增殖的差異總體具有統(tǒng)計學意義(F值=159.036,P值0.001)。 3.流式檢測細胞周期實驗中,miR-200過表達的貼壁生長EOC細胞和對照組細胞,G0/G1、S、G2/M期所占比例(%)分別為(55.86±2.55vs.72.41±3.22),(26.15±2.30vs.21.76±2.11),(13.52±1.99vs.6.82±0.76)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞與對照組細胞,G0/G1、S、G2/M期比例的差異分別為(t值=9.861,P值0.001)、(t值=-3.445,P值=0.006)、(t值=-7.686,P值0.001),均具有統(tǒng)計學意義。 miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞和對照組細胞,Go/G1、S、G2/M期所占比例(%)分別為(69.52±3.24vs.90.48±2.36),(21.35±2.10vs.5.49±0.52),(11.31±1.43vs.3.32±0.28)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的懸浮生長EOC細胞與對照組細胞,G0/G1、S、G2/M期比例的差異分別為(t值=11.470,P值0.001)、(t值=-17.926,P值=0.006)、(t值=-13.386,P值0.001),均具有統(tǒng)計學意義。 4.裸鼠皮下移植瘤實驗中,miR-200過表達的EOC細胞和對照細胞均能在裸鼠皮下生長形成腫瘤。miR-200a過表達的皮下移植瘤和對照移植瘤體積(mm3),在皮下接種移植后50、53、56、59、62d分別為(110.27±57.84vs.58.19±19.55),(146.88±73.64vs.67.44±32.58),(167.03±75.68vs.82.25±48.15),(234.01±80.85vs.108.74±42.98),(366.36±99.87vs.137.44±43.13)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的EOC細胞與對照組細胞,裸鼠皮下移植瘤增長的差異總體具有統(tǒng)計學意義(F值=63.441,P值0.001)。 5.免疫組化檢測移植瘤組織中Ki67表達的實驗中,miR-200a過表達和對照移植瘤組織中Ki67陽性表達率(%)為(70.91±5.18vs.15.21±3.52)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達和對照移植瘤組織中,Ki67陽性表達率差異具有統(tǒng)計學意義(t值=-25.156,P值0.001)。 結(jié)論： 1.過表達miR-200a增加了EOC細胞平板克隆形成率；促進了貼壁及懸浮生長EOC細胞的生長、誘導其進入增殖周期；有益于EOC細胞裸鼠皮下移植瘤生長；說明miR-200a具有促進EOC細胞的增殖的作用。這種促增殖效應可能是miR-200a增加EOC細胞對紫杉醇敏感性的作用機制之一。 第三節(jié)MiR-200a調(diào)控EOC中CSCs的作用及其機制 目的： 以上研究發(fā)現(xiàn)miR-200a對EOC細胞株紫杉醇敏感性及增殖狀態(tài)具有一定的調(diào)控作用,接下來我們擬探索miR-200a調(diào)控EOC中CSCs的作用及其機制。通過腫瘤球形成實驗、流氏細胞儀檢測側(cè)群(side population,SP)細胞比例、檢測CSCs特性相關基因表達水平,驗證miR-200a對EOC中CSCs干性特征的調(diào)控作用及其機制。 方法： 1.腫瘤球形成實驗檢測miR-200a對EOC細胞自我更新能力的影響。 收集miR-200a過表達的EOC細胞和對照細胞,重懸于腫瘤球培養(yǎng)基,按1×103細胞/孔分別接種于超低吸附24孔板內(nèi),每組三個復孔,常規(guī)培養(yǎng)7d,倒置熒光顯微鏡下觀察腫瘤球形態(tài),計數(shù)直徑≥-70μm的腫瘤球個數(shù)。實驗重復三次。 2.流氏細胞儀檢測SP細胞比例,驗證miR-200a對EOC中CSCs比例的影響。 收集miR-200a過表達的貼壁生長EOC細胞和對照組細胞,重懸于已預熱為37℃含2%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基,調(diào)整細胞密度至1×106/mL,每組各準備兩管細胞,四管細胞中均加入Hoeehst33342終濃度為5ug/mL,在每組細胞中隨機選擇一管再加入維拉帕米終濃度為50μmol/L,37℃搖床避光孵育90min后放于冰上終止反應。4℃1000rpm離心3min,棄上清,預冷PBS洗滌一次。40μm濾器過濾待檢測細胞,檢測前加入碘化丙淀(PI)終濃度1μg/mL標記死細胞。流式細胞儀檢測SP比例,Hoeehst33342激發(fā)光波長為350nm,405/30帶通收集藍光,570/20帶通收集紅光,PI用488nm藍光激發(fā),630/30帶通收集紅光。去除PI直接染色陽性的死細胞,以Hoechst Red為X軸,Hoechst Blue為Y軸作二維散點圖。設門選低Hoechst Red及低Hoechst Blue且維拉帕米組缺失的區(qū)域為SP細胞。比較SP細胞比例在miR-200a過表達的EOC細胞與對照組細胞間的差別。 3. qRT-PCR和Western Blot檢測miR-200a對EOC細胞中CSCs相關基因表達的調(diào)控作用。 qRT-PCR檢測方法如下,提取miR-200a過表達的EOC細胞和對照組細胞總RNA,將mRNA逆轉(zhuǎn)為cDNA, qRT-PCR檢測(SYBR法)SOX2和OCT4mRNA水平,以GAPDH作為內(nèi)源性對照。 Western Blot檢測方法如下,提取miR-200a過表達的EOC細胞和對照組細胞總蛋白,BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度,每個泳道加30μg蛋白樣品,SDS-PAGE將蛋白分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,3%BSA拮抗非特異性位點,分別用SOX2和OCT4的一抗(稀釋比例1：1000),4℃孵育過夜,相應二抗室溫孵育1h,增強型化學發(fā)光系統(tǒng)(ECL)觀察蛋白印跡,以P-actin作為內(nèi)源性對照。 4.利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行處理,采用兩個獨立樣本的t檢驗分析腫瘤球形成差異、SP細胞比例差異,單樣本的t檢驗分析qRT-PCR和Western Blot檢測SOX2和OCT4表達差異。P0.05認為差異有統(tǒng)計學意義,數(shù)據(jù)用“均數(shù)士標準差”表示。 結(jié)果： 1.腫瘤球形成實驗中,我們觀察到有部分miR-200a過表達的EOC細胞,在超低吸附培養(yǎng)皿中亦可貼壁生長,并以貼壁方式逐漸增殖,而對照組中幾乎沒有腫瘤球細胞貼壁生長的現(xiàn)象。miR-200a過表達的EOC細胞和對照細胞,腫瘤球形成個數(shù)(/1000個細胞)分別為(7.17±1.17vs.17.50±1.87)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的EOC細胞與對照組細胞,腫瘤球形成個數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義(t值=11.474,P值0.001)。 2.流式細胞儀檢測SP細胞比例的實驗中,miR-200a過表達的EOC細胞和對照細胞SP細胞比例(%)為(0.233±0.076vs.0.850±0.100)。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的EOC細胞和對照細胞,SP細胞比例差異具有統(tǒng)計學意義(t值=8.488,P值=0.001)。 3. qRT-PCR檢測miR-200a過表達的EOC細胞中SOX2和OCT4mRNA水平分別下降至對照細胞的0.467和0.361倍。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的EOC細胞與對照組細胞,SOX2和OCT4mRNA水平差異均具有統(tǒng)計學意義(t值=-10.932,P=0.008)和(t值=-17.416,P值=0.003)。 Western Blot結(jié)果提示miR-200過表達的EOC中細胞中,SOX2和OCT4蛋白表達水平分別下降至對照細胞的0.546和0.518倍。統(tǒng)計分析結(jié)果提示,miR-200a過表達的EOC細胞與對照組細胞,SOX2和OCT4蛋白水平差異均具有統(tǒng)計學意義(t值=-10.191,P值=0.009)和(t值=-9.659,P值=0.011)。 結(jié)論： 過表達miR-200a通過抑制EOC細胞自我更新能力、誘導分化、降低SP細胞比例、下調(diào)干性相關基因SOX2和OCT4的表達,弱化了EOC中CSCs的干性特征。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

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1 王偉;王沂峰;張嶺梅;林瓊燕;黃菊;;人卵巢癌OVCAR3細胞系中側(cè)群細胞的分離及其成瘤性、侵襲性的實驗研究[J];山東大學學報(醫(yī)學版);2009年06期

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本文編號：2408171