發(fā)布時(shí)間：2018-12-28 16:59

【摘要】：子癇前期(pre-eclampsia,PE)是指妊娠20周以后出現(xiàn)新發(fā)的高血壓,且伴有蛋白尿或其他系統(tǒng)損害的一種妊娠期并發(fā)癥�，F(xiàn)在的發(fā)病率已達(dá)到3-5%,嚴(yán)重的系統(tǒng)損害使其成為孕婦圍產(chǎn)期發(fā)病率和死亡率升高的主要原因,而子癇前期的發(fā)病機(jī)制尚未明確。滋養(yǎng)細(xì)胞作為人類(lèi)胎盤(pán)的主要組成部分,在維持正常妊娠的過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用,其來(lái)源于囊胚表面的滋養(yǎng)層,在晚期囊胚黏附于子宮內(nèi)膜時(shí),滋養(yǎng)細(xì)胞開(kāi)始分化,并侵襲入子宮內(nèi)膜、內(nèi)1/3肌層及血管,保證胎盤(pán)接受足夠的血流供應(yīng),維持胚胎正常發(fā)育。已有研究證實(shí),滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲不足會(huì)導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生。線(xiàn)粒體偶聯(lián)因子6(coupling factor 6,CF6)又稱(chēng)ATP5J,是ATP合酶的一部分,表達(dá)于多種細(xì)胞的線(xiàn)粒體及細(xì)胞膜上,參與ATP的合成和水解,以供給細(xì)胞能量,并能被分泌入血液,以循環(huán)肽的形式與相應(yīng)配體結(jié)合,激活下游信號(hào),引起血管穩(wěn)態(tài)的改變。有研究發(fā)現(xiàn),在某些缺血缺氧性心肌病中,出現(xiàn)了CF6的高表達(dá),提示缺血缺氧可能促進(jìn)了該因子的表達(dá)和釋放,而相較于正常晚孕期產(chǎn)婦和正常育齡期未孕婦女,PE產(chǎn)婦的外周血中出現(xiàn)了明顯的CF6的升高。因此我們猜想,胎盤(pán)可能表達(dá)并分泌了一部分CF6,參與了子癇前期患者外周血中CF6的升高。本研究期望通過(guò)檢測(cè)子癇前期孕婦胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中CF6 mRNA和蛋白的表達(dá),探討CF6與PE發(fā)病的相關(guān)性。人絨毛膜癌滋養(yǎng)細(xì)胞系JAR與JEG-3細(xì)胞具有與滋養(yǎng)細(xì)胞相似的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性狀,常代替正常滋養(yǎng)細(xì)胞,用以研究其生物學(xué)行為。本文在研究CF6與PE發(fā)病相關(guān)性的基礎(chǔ)上,探討CF6對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其與PE發(fā)病的關(guān)系,為明確子癇前期發(fā)病機(jī)制提供新的研究方向。目的檢測(cè)子癇前期患者胎盤(pán)組織中線(xiàn)粒體偶聯(lián)因子6(coupling factor 6,CF6)的表達(dá)情況,探討其與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性。研究缺氧條件下,CF6在滋養(yǎng)細(xì)胞系JAR及JEG-3中的表達(dá)、分泌情況,及外源性CF6對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,初步探索CF6在子癇前期發(fā)病中的作用。材料和方法1研究對(duì)象胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞組織芯片(villous cytotrophoblast,VCT)和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞組織芯片(extravillous cytotrophoblast,EVCT)用來(lái)檢測(cè)CF6在胎盤(pán)組織中的表達(dá)定位。兩種芯片的胎盤(pán)組織來(lái)源于2007年12月到2010年12月間在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院住院的,臨床診斷為子癇前期的患者胎盤(pán)80例,同期正常晚孕產(chǎn)婦胎盤(pán)58例。另收集60例新鮮胎盤(pán)組織用以檢測(cè)CF6 mRNA和蛋白在胎盤(pán)組織中的表達(dá)水平,該胎盤(pán)組織來(lái)源于2015年1月至2016年1月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院分娩的重度子癇前期(severe preeclampsia,sPE)患者30例,同期分娩的正常對(duì)照孕婦30例。滋養(yǎng)細(xì)胞系JAR和JEG-3購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,使用完全培養(yǎng)基(RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%FBS、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素),置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。2方法免疫組化SABC法檢測(cè)CF6蛋白在胎盤(pán)VCT及EVCT組織芯片中的定位和表達(dá)情況。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)CF6在新鮮胎盤(pán)組織中的表達(dá)情況。正常培養(yǎng)兩株滋養(yǎng)細(xì)胞系JAR和JEG-3,采用氯化鈷(cobalt chloride,CoCl2)培養(yǎng)細(xì)胞以構(gòu)建缺氧細(xì)胞模型,免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白的表達(dá),評(píng)價(jià)細(xì)胞缺氧模型的構(gòu)建成功與否。缺氧培養(yǎng)24h,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)正常對(duì)照組及缺氧組細(xì)胞培養(yǎng)液中CF6的濃度,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)CF6在兩組滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。正常培養(yǎng)基中加入外源性人重組CF6蛋白進(jìn)行干預(yù),繼續(xù)培養(yǎng)24h后,MTT法檢測(cè)對(duì)照組和CF6實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖力的變化,Transwell法檢測(cè)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的變化,實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法檢測(cè)兩組細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)。3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本研究中所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理,定量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以?x±s的方式表示,兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用M(P25~P75)的方式表示,非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析;重復(fù)測(cè)量資料采用重復(fù)測(cè)量資料的多因素方差分析;定性資料采用非參數(shù)檢驗(yàn),以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。結(jié)果1 CF6蛋白在胎盤(pán)組織芯片中的定位和表達(dá)CF6蛋白在PE組與對(duì)照組的胎盤(pán)VCT及EVCT組織芯片中均有表達(dá),主要表達(dá)于滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜。VCT組織芯片中,對(duì)照組CF6陽(yáng)性表達(dá)率為71.4%,PE組CF6陽(yáng)性表達(dá)率為83.9%,其中sPE組為87.5%;EVCT組織芯片中,對(duì)照組CF6陽(yáng)性表達(dá)率為75.9%,PE組CF6陽(yáng)性表達(dá)率為83%,其中sPE組為81.8%。無(wú)論VCT或EVCT組織芯片,CF6在sPE胎盤(pán)組織中的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)2胎盤(pán)組織中CF6 mRNA及蛋白的表達(dá)對(duì)照組與sPE組胎盤(pán)組織中均可檢測(cè)到CF6 mRNA和蛋白的表達(dá),sPE組CF6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(1.522±0.727),對(duì)照組CF6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量為(1.000±0.566);sPE組與正常對(duì)照組胎盤(pán)組織CF6蛋白的表達(dá)分別為0.282(0.111~0.341),(0.180±0.105)。與對(duì)照組比較,CF6 mRNA和蛋白在sPE胎盤(pán)組織中的表達(dá)均升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3缺氧細(xì)胞模型的構(gòu)建免疫印跡法檢測(cè)經(jīng)CoCl2干預(yù)培養(yǎng)的JAR和JEG-3細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá),JAR細(xì)胞的對(duì)照組和CoCl2處理組HIF-1α蛋白表達(dá)分別為(0.311±0.193),(1.170±0.295);JEG-3細(xì)胞的對(duì)照組和CoCl2處理組HIF-1α蛋白表達(dá)分別為(0.210±0.101),(0.795±0.304)。經(jīng)CoCl2處理后,細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增高,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示細(xì)胞缺氧,即缺氧細(xì)胞模型構(gòu)建成功。4缺氧條件下細(xì)胞培養(yǎng)液中CF6的濃度ELISA法檢測(cè)顯示,對(duì)照組與缺氧組的JAR及JIG-3細(xì)胞均能分泌CF6,且缺氧組細(xì)胞培養(yǎng)液中的CF6濃度明顯高于正常對(duì)照組。JAR細(xì)胞的對(duì)照組與缺氧組培養(yǎng)液中CF6濃度分別為(1.444±0.621)ng/ml,(2.223±0.662)ng/ml;JEG-3細(xì)胞的對(duì)照組與缺氧組培養(yǎng)液中CF6濃度分別為(1.691±0.392)ng/ml,(2.106±0.508)ng/ml,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5缺氧條件下細(xì)胞中CF6的表達(dá)Real-time PCR及免疫印跡法檢測(cè)顯示,缺氧組與正常對(duì)照組的JAR及JIG-3細(xì)胞均表達(dá)CF6 mRNA和蛋白,但CF6 mRNA在兩株細(xì)胞的對(duì)照組和缺氧組中表達(dá)水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其中,JAR兩組細(xì)胞的表達(dá)為(1.000±0.466),(1.361±0.507);JEG-3兩組細(xì)胞的表達(dá)為(1.000±0.357),(0.974±0.308)。而兩株細(xì)胞缺氧組CF6蛋白的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組,對(duì)照組和缺氧組JAR細(xì)胞中的CF6蛋白表達(dá)量分別為(0.270±0.163),(0.464±0.205);對(duì)照組和缺氧組JEG-3細(xì)胞中的CF6蛋白表達(dá)量分別為(0.194±0.118),(0.385±0.205),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6 CF6刺激下滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況MTT法檢測(cè)顯示,分別在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入CF6后繼續(xù)培養(yǎng),并于0h、6h、12h、18h、24h這五個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的吸光度OD值,并繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn),CF6刺激組的細(xì)胞增殖較正常對(duì)照組略有降低,經(jīng)重復(fù)測(cè)量資料的多因素方差分析,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7 CF6刺激下滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲情況Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示,兩株細(xì)胞CF6刺激組的細(xì)胞侵襲數(shù)均明顯少于正常對(duì)照組,對(duì)照組和CF6刺激組JAR細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(86.17±20.56)個(gè),(63.67±19.78)個(gè);兩組JEG-3細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(87.06±12.03)個(gè),(73.67±10.53)個(gè),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);兩株細(xì)胞CF6刺激組的MMP-2表達(dá)水平均明顯低于正常對(duì)照組,對(duì)照組和CF6刺激組JAR細(xì)胞中MMP-2 mRNA的表達(dá)分別為(1.000±0.360),(0.346±0.221),MMP-2蛋白的表達(dá)分別為(0.410±0.192),(0.201±0.186);JEG-3細(xì)胞中MMP-2 mRNA的表達(dá)分別為(1.000±0.402),(0.671±0.229),MMP-2蛋白的表達(dá)分別為(0.528±0.236),(0.251±0.154)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)照組和CF6刺激組JAR細(xì)胞中MMP-9 mRNA的表達(dá)分別為(1.000±0.384),(0.880±0.242),MMP-9蛋白的表達(dá)分別為(0.241±0.110),(0.240±0.184);JEG-3細(xì)胞中MMP-9 mRNA的表達(dá)分別為(1.000±0.336),(0.959±0.326),MMP-9蛋白的表達(dá)分別為(0.370±0.201),(0.349±0.219)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)結(jié)論缺氧可能促進(jìn)了胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中CF6的表達(dá)和分泌,通過(guò)影響周?chē)甜B(yǎng)細(xì)胞的侵襲力,干擾螺旋動(dòng)脈重鑄,損傷母體血管內(nèi)皮細(xì)胞,參與子癇前期的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R714.244

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1 沈方;子癇前期患者脫落滋養(yǎng)細(xì)胞激活血管內(nèi)皮細(xì)胞的分子機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 周麗娟;MAP4調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞遷移在子癇前期發(fā)病中作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 劉偉;IL-33對(duì)母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控作用[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

4 沈莉;MiR-155通過(guò)調(diào)節(jié)CD81影響滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移及侵襲[D];南京大學(xué);2013年

5 岳寧;Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞GCM-1/HtrA4的表達(dá)及細(xì)胞侵襲力的影響[D];鄭州大學(xué);2016年

6 李曉倩;雙酚A對(duì)母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

7 孫丹丹;胎盤(pán)特異性蛋白-1對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的影響[D];浙江大學(xué);2016年

8 洪國(guó)敏;姜黃素抑制脂多糖誘導(dǎo)的人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞miR-155表達(dá)及細(xì)胞凋亡[D];南京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

9 朱莉莉;滋養(yǎng)細(xì)胞促進(jìn)iNKT細(xì)胞擴(kuò)增及殺傷功能的研究[D];浙江大學(xué);2017年

10 趙丹;STAT3信號(hào)通路對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞VEGF、sFlt-1表達(dá)的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2017年

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本文編號(hào)：2394203