【摘要】：研究背景 輔助生殖技術(shù)(ART)已經(jīng)成為治療人類不孕不育的一個(gè)重要手段和途徑。臨床研究發(fā)現(xiàn)，染色體異常胚胎（非整倍體胚胎）的比例高（50-70%），而非整倍體胚胎植入是導(dǎo)致生殖助孕后妊娠率和著床率較低的原因之一，同時(shí)也是導(dǎo)致出生缺陷發(fā)生的原因。很多報(bào)道指出，在高齡、反復(fù)植入失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、非整倍體妊娠婦女中胚胎非整倍體發(fā)生率非常高。植入前遺傳學(xué)篩查（Preimplantationgenetic screening, PGS）技術(shù)，通過體外受精（In-vitro fertilization, IVF）獲得卵母細(xì)胞或胚胎，經(jīng)活檢遺傳學(xué)分析，選擇正常胚胎移植，可避免遺傳病妊娠發(fā)生，將產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷提前到胚胎植入之前。當(dāng)前，利用PGS技術(shù)可以診斷40多種包括常染色體顯性、隱性及X性連鎖遺傳的變異，該技術(shù)具有重大的優(yōu)生學(xué)意義，也是診斷植入前胚胎非整倍性和其他染色體異常的一種重要手段。隨著PGS技術(shù)的迅速發(fā)展，其在PGS中的應(yīng)用必將越來越廣泛，未來將有更多新技術(shù)應(yīng)用于臨床，能有效篩選染色體異常的胚胎，提高輔助生殖技術(shù)成功率。 研究目的 把Oligo DNA芯片應(yīng)用于人類胚胎植入前遺傳學(xué)篩查，評(píng)估該芯片在PGS中應(yīng)用價(jià)值，希望用這種新的芯片技術(shù)確定胚胎中微小的染色體異常，從而篩選PGS中染色體正常的胚胎進(jìn)行移植，提高胚胎著床率和臨床妊娠率。研究方法在本研究中，我們對(duì)進(jìn)行體外受精（IVF）的病人第5/6天的囊胚進(jìn)行活檢，并進(jìn)行Oligo DNA芯片檢測，結(jié)果異常的囊胚進(jìn)行FISH檢查進(jìn)一步確定Oligo DNA芯片的準(zhǔn)確性。Oligo DNA芯片篩選后正常囊胚進(jìn)行FET，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 研究結(jié)果 1、寡核苷酸基因芯片可檢測到更小的染色體異常片段 630K寡核苷酸基因芯片最小可檢測小至1.3mb大小的異常片段， Oligo基因芯片平臺(tái)比BAC平臺(tái)靈敏度更高。 2.植入前胚胎中非整倍體、部分染色體缺失或重復(fù)發(fā)生率較高 全部樣本進(jìn)行基因檢測后發(fā)現(xiàn)41.9%為正常整倍體囊胚，58.1%為異常囊胚，219個(gè)異常囊胚中，94個(gè)（42.9%）為單條染色體發(fā)生錯(cuò)誤，101個(gè)（46.1%）為多條染色體發(fā)生錯(cuò)誤，15個(gè)（6.9%）為正常整倍體但某些染色體部分缺失，7個(gè)（3.2%）為正常整倍體但某些染色體部分重復(fù)，2個(gè)（0.9%）為正常整倍體但某些染色體同時(shí)部分缺失和重復(fù)。 3、移植正常整倍體囊胚可獲得較高的妊娠率和胚胎著床率。 31個(gè)病人進(jìn)行了34次FET，結(jié)果臨床妊娠率為58.8%，胚胎著床率為54.4%。而我們的研究中沒有發(fā)現(xiàn)高齡婦女組與反復(fù)性流產(chǎn)婦女組之間在臨床妊娠率和胚胎著床率方面有明顯差異。 4、Oligo基因芯片準(zhǔn)確性評(píng)估 我們用10個(gè)已知染色體異常的囊胚進(jìn)一步進(jìn)行FISH檢測，所有樣本進(jìn)行FISH后結(jié)果均與Oligo基因芯片檢測結(jié)果相符。 研究結(jié)論 1、在高齡患者和/或反復(fù)流產(chǎn)患者植入前囊胚中非整倍體發(fā)生率較高，在高齡患者中非整倍體發(fā)生率更高。 2、Oligo基因芯片檢測可用于檢測囊胚活檢細(xì)胞的大部分染色體異常，如非整倍體、部分染色體缺失和/或重復(fù)。 3、移植芯片檢測篩查后的囊胚能明顯提高臨床妊娠率和胚胎著床率。 4、Oligo基因芯片將來可在IVF-PGS過程中可作為常規(guī)手段在更多臨床患者中使用。 研究背景 輔助生殖技術(shù)解決了包括排卵困難、內(nèi)分泌異常，少、弱精子癥等患者受孕困難的問題，然而，大量研究均表明，高齡婦女進(jìn)行輔助受孕后妊娠結(jié)局明顯低于育齡婦女，其關(guān)鍵問題在于高齡婦女的卵子出現(xiàn)了不可逆轉(zhuǎn)的老化現(xiàn)象。就目前而言，隨著女性生育年齡不斷推遲，導(dǎo)致卵子老化的問題日益嚴(yán)重，同時(shí)也為輔助生殖技術(shù)提出更高要求。有研究表明，衰老卵子其染色體出現(xiàn)非整倍體異常的概率比年輕卵子高。雖然年輕婦女染色體異常低于高齡婦女，但今年來有上升的趨勢，環(huán)境因素可能是引起卵子提早衰老的主要原因之一。衰老卵子與卵子非整倍體的形成之間關(guān)系一直沒有得到解決，而造成卵子染色體異常的原因和卵子內(nèi)的超微細(xì)胞器變化的機(jī)理仍然不太清楚。 研究目的 從細(xì)胞水平上了解體外成熟培養(yǎng)的卵子其超微結(jié)構(gòu)變化與非整倍體發(fā)生及卵子受精發(fā)育潛能的關(guān)系，并通過添加重金屬耦合劑和抗氧化劑觀察是否能降低卵子內(nèi)氧化應(yīng)激水平，從而保護(hù)卵子免受氧化應(yīng)激損傷，提高卵子受精發(fā)育能力，在防止卵子老化和為高齡婦女提供輔助生殖策略等方面均有重要的意義。 研究方法 1、C57BL/6J小鼠GV期卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)。 1.1GV期卵母細(xì)胞分別置于4個(gè)不同體外成熟培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。A組為添加重金屬耦合劑的IVM培養(yǎng)體系；B組為添加抗氧化劑的IVM培養(yǎng)體系；C組為同時(shí)添加重金屬耦合和抗氧化劑的IVM培養(yǎng)體系；D組為普通IVM培養(yǎng)體系。 1.24個(gè)體外成熟培養(yǎng)體系的卵母細(xì)胞分別培養(yǎng)12-14小時(shí)、24-26小時(shí)、46-48小時(shí)。 2、卵母細(xì)胞染色體檢查。采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行染色體檢查。 3、卵母細(xì)胞線粒體膜電位檢測。采用免疫熒光標(biāo)記JC-1法進(jìn)行細(xì)胞線粒體檢查。 4、卵母細(xì)胞內(nèi)ATP含量檢測。采用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行細(xì)胞ATP含量檢查。 5、卵母細(xì)胞紡錘體檢查。采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行紡錘體檢查。 6、卵母細(xì)胞受精發(fā)育能力檢查。 對(duì)成熟卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF，計(jì)算2細(xì)胞形成率。 研究結(jié)果 1、卵子體外成熟過程中非整倍體發(fā)生率較高，并隨著時(shí)間增長而增高，，而添加重金屬耦合劑和抗氧化劑對(duì)防止非整倍體形成沒有明顯影響。 2、重金屬耦合劑和抗氧化劑影響IVM體外衰老卵子的線粒體活性，提高衰老卵子線粒體活性。 3、體外成熟衰老過程中紡錘體異常率隨時(shí)間變化逐漸增高，重金屬耦合劑和抗氧化劑在可能早期體外培養(yǎng)過程中能防止異常紡錘體形成。 4、卵子內(nèi)ATP濃度隨老化時(shí)間增長而降低，重金屬耦合劑和抗氧化劑不能明顯提高卵子細(xì)胞內(nèi)ATP含量。 5、重金屬耦合劑組和抗氧化劑未能明顯提高M(jìn)II期卵子成熟率，但能提高IVF受精率。 研究結(jié)論 1、體外成熟的GV卵子非整倍體發(fā)生率較高，培養(yǎng)時(shí)間越長非整倍體發(fā)生率越高，而在培養(yǎng)液中加入重金屬耦合劑和抗氧化劑培養(yǎng)未能降低其非整倍體發(fā)生率。 2、衰老卵子超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，重金屬耦合劑和抗氧化劑可提高線粒體活性，減低異常紡錘體形成，而對(duì)卵子內(nèi)ATP含量沒有直接影響。 3、隨著體外成熟時(shí)間延長，卵子體外衰老過程中卵子受精能力明顯降低，而加入重金屬耦合劑和抗氧化劑后能延緩卵子衰老時(shí)間，增強(qiáng)其受精能力。
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【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 霍生東;龍玲;阿依木古麗;盧建雄;楊具田;陳士恩;;光照及溫度對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響[J];貴州農(nóng)業(yè)科學(xué);2010年12期

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本文編號(hào)：2391831