【摘要】：研究背景 輔助生殖技術(ART)已經成為治療人類不孕不育的一個重要手段和途徑。臨床研究發(fā)現(xiàn)，染色體異常胚胎（非整倍體胚胎）的比例高（50-70%），而非整倍體胚胎植入是導致生殖助孕后妊娠率和著床率較低的原因之一，同時也是導致出生缺陷發(fā)生的原因。很多報道指出，在高齡、反復植入失敗、復發(fā)性流產、非整倍體妊娠婦女中胚胎非整倍體發(fā)生率非常高。植入前遺傳學篩查（Preimplantationgenetic screening, PGS）技術，通過體外受精（In-vitro fertilization, IVF）獲得卵母細胞或胚胎，經活檢遺傳學分析，選擇正常胚胎移植，可避免遺傳病妊娠發(fā)生，將產前遺傳學診斷提前到胚胎植入之前。當前，利用PGS技術可以診斷40多種包括常染色體顯性、隱性及X性連鎖遺傳的變異，該技術具有重大的優(yōu)生學意義，也是診斷植入前胚胎非整倍性和其他染色體異常的一種重要手段。隨著PGS技術的迅速發(fā)展，其在PGS中的應用必將越來越廣泛，未來將有更多新技術應用于臨床，能有效篩選染色體異常的胚胎，提高輔助生殖技術成功率。 研究目的 把Oligo DNA芯片應用于人類胚胎植入前遺傳學篩查，評估該芯片在PGS中應用價值，希望用這種新的芯片技術確定胚胎中微小的染色體異常，從而篩選PGS中染色體正常的胚胎進行移植，提高胚胎著床率和臨床妊娠率。研究方法在本研究中，我們對進行體外受精（IVF）的病人第5/6天的囊胚進行活檢，并進行Oligo DNA芯片檢測，結果異常的囊胚進行FISH檢查進一步確定Oligo DNA芯片的準確性。Oligo DNA芯片篩選后正常囊胚進行FET，并進行數據統(tǒng)計分析。 研究結果 1、寡核苷酸基因芯片可檢測到更小的染色體異常片段 630K寡核苷酸基因芯片最小可檢測小至1.3mb大小的異常片段， Oligo基因芯片平臺比BAC平臺靈敏度更高。 2.植入前胚胎中非整倍體、部分染色體缺失或重復發(fā)生率較高 全部樣本進行基因檢測后發(fā)現(xiàn)41.9%為正常整倍體囊胚，58.1%為異常囊胚，219個異常囊胚中，94個（42.9%）為單條染色體發(fā)生錯誤，101個（46.1%）為多條染色體發(fā)生錯誤，15個（6.9%）為正常整倍體但某些染色體部分缺失，7個（3.2%）為正常整倍體但某些染色體部分重復，2個（0.9%）為正常整倍體但某些染色體同時部分缺失和重復。 3、移植正常整倍體囊胚可獲得較高的妊娠率和胚胎著床率。 31個病人進行了34次FET，結果臨床妊娠率為58.8%，胚胎著床率為54.4%。而我們的研究中沒有發(fā)現(xiàn)高齡婦女組與反復性流產婦女組之間在臨床妊娠率和胚胎著床率方面有明顯差異。 4、Oligo基因芯片準確性評估 我們用10個已知染色體異常的囊胚進一步進行FISH檢測，所有樣本進行FISH后結果均與Oligo基因芯片檢測結果相符。 研究結論 1、在高齡患者和/或反復流產患者植入前囊胚中非整倍體發(fā)生率較高，在高齡患者中非整倍體發(fā)生率更高。 2、Oligo基因芯片檢測可用于檢測囊胚活檢細胞的大部分染色體異常，如非整倍體、部分染色體缺失和/或重復。 3、移植芯片檢測篩查后的囊胚能明顯提高臨床妊娠率和胚胎著床率。 4、Oligo基因芯片將來可在IVF-PGS過程中可作為常規(guī)手段在更多臨床患者中使用。 研究背景 輔助生殖技術解決了包括排卵困難、內分泌異常，少、弱精子癥等患者受孕困難的問題，然而，大量研究均表明，高齡婦女進行輔助受孕后妊娠結局明顯低于育齡婦女，其關鍵問題在于高齡婦女的卵子出現(xiàn)了不可逆轉的老化現(xiàn)象。就目前而言，隨著女性生育年齡不斷推遲，導致卵子老化的問題日益嚴重，同時也為輔助生殖技術提出更高要求。有研究表明，衰老卵子其染色體出現(xiàn)非整倍體異常的概率比年輕卵子高。雖然年輕婦女染色體異常低于高齡婦女，但今年來有上升的趨勢，環(huán)境因素可能是引起卵子提早衰老的主要原因之一。衰老卵子與卵子非整倍體的形成之間關系一直沒有得到解決，而造成卵子染色體異常的原因和卵子內的超微細胞器變化的機理仍然不太清楚。 研究目的 從細胞水平上了解體外成熟培養(yǎng)的卵子其超微結構變化與非整倍體發(fā)生及卵子受精發(fā)育潛能的關系，并通過添加重金屬耦合劑和抗氧化劑觀察是否能降低卵子內氧化應激水平，從而保護卵子免受氧化應激損傷，提高卵子受精發(fā)育能力，在防止卵子老化和為高齡婦女提供輔助生殖策略等方面均有重要的意義。 研究方法 1、C57BL/6J小鼠GV期卵母細胞體外成熟培養(yǎng)。 1.1GV期卵母細胞分別置于4個不同體外成熟培養(yǎng)體系中培養(yǎng)。A組為添加重金屬耦合劑的IVM培養(yǎng)體系；B組為添加抗氧化劑的IVM培養(yǎng)體系；C組為同時添加重金屬耦合和抗氧化劑的IVM培養(yǎng)體系；D組為普通IVM培養(yǎng)體系。 1.24個體外成熟培養(yǎng)體系的卵母細胞分別培養(yǎng)12-14小時、24-26小時、46-48小時。 2、卵母細胞染色體檢查。采用免疫熒光細胞化學法進行染色體檢查。 3、卵母細胞線粒體膜電位檢測。采用免疫熒光標記JC-1法進行細胞線粒體檢查。 4、卵母細胞內ATP含量檢測。采用化學發(fā)光法進行細胞ATP含量檢查。 5、卵母細胞紡錘體檢查。采用免疫熒光細胞化學法進行紡錘體檢查。 6、卵母細胞受精發(fā)育能力檢查。 對成熟卵母細胞進行IVF，計算2細胞形成率。 研究結果 1、卵子體外成熟過程中非整倍體發(fā)生率較高，并隨著時間增長而增高，，而添加重金屬耦合劑和抗氧化劑對防止非整倍體形成沒有明顯影響。 2、重金屬耦合劑和抗氧化劑影響IVM體外衰老卵子的線粒體活性，提高衰老卵子線粒體活性。 3、體外成熟衰老過程中紡錘體異常率隨時間變化逐漸增高，重金屬耦合劑和抗氧化劑在可能早期體外培養(yǎng)過程中能防止異常紡錘體形成。 4、卵子內ATP濃度隨老化時間增長而降低，重金屬耦合劑和抗氧化劑不能明顯提高卵子細胞內ATP含量。 5、重金屬耦合劑組和抗氧化劑未能明顯提高MII期卵子成熟率，但能提高IVF受精率。 研究結論 1、體外成熟的GV卵子非整倍體發(fā)生率較高，培養(yǎng)時間越長非整倍體發(fā)生率越高，而在培養(yǎng)液中加入重金屬耦合劑和抗氧化劑培養(yǎng)未能降低其非整倍體發(fā)生率。 2、衰老卵子超微結構發(fā)生明顯改變，重金屬耦合劑和抗氧化劑可提高線粒體活性，減低異常紡錘體形成，而對卵子內ATP含量沒有直接影響。 3、隨著體外成熟時間延長，卵子體外衰老過程中卵子受精能力明顯降低，而加入重金屬耦合劑和抗氧化劑后能延緩卵子衰老時間，增強其受精能力。
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【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8

【參考文獻】

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1 霍生東;龍玲;阿依木古麗;盧建雄;楊具田;陳士恩;;光照及溫度對小鼠卵母細胞體外成熟培養(yǎng)的影響[J];貴州農業(yè)科學;2010年12期

2 ;Deficit of mitochondria-derived ATP during oxidative stress impairs mouse MII oocyte spindles[J];Cell Research;2006年10期

本文編號：2391831