【摘要】：背景與目的 滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源于形成中胚泡的滋養(yǎng)內(nèi)胚層，根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為：細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞、合體滋養(yǎng)細(xì)胞和中間型滋養(yǎng)細(xì)胞。滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及程序性入侵是人類(lèi)胚胎植入、胎盤(pán)形成發(fā)育、胎兒生長(zhǎng)發(fā)育以及妊娠順利完成的重要因素。已有研究表明，子癇前期的發(fā)生與滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，子癇前期患者的胎盤(pán)組織中存在滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)度現(xiàn)象，，且胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡程度與子癇前期的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。 子癇前期(pre-eclampsia，PE)是指妊娠20周以后出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、水腫，并伴有全身各器官系統(tǒng)損害，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦及其圍生兒患病率和死亡率升高的重要原因之一。目前認(rèn)為，子癇前期是胎盤(pán)依賴(lài)性疾病，胎盤(pán)一旦娩出，患者的相關(guān)癥狀立即消失。因其發(fā)病的迅猛性、病情的復(fù)雜性及其危害，子癇前期的病因及其發(fā)病機(jī)制的研究一直是婦產(chǎn)科領(lǐng)域的重要課題。目前較為公認(rèn)的學(xué)說(shuō)之一是滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺血學(xué)說(shuō)：即在妊娠早期，滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡過(guò)度引起滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)能力下降以及血管內(nèi)滋養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程發(fā)生異常，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞激活和損傷，胎盤(pán)淺著床，胎盤(pán)缺血缺氧，使得子宮螺旋小動(dòng)脈生理性重鑄障礙，從而引起子癇前期相關(guān)癥狀。 雙特異性磷酸酶(dual specificity phosphatase，DUSP)是近年來(lái)才發(fā)現(xiàn)的，是蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases，PTPs)超家族的一個(gè)亞家族，因其對(duì)酪氨酸和絲/蘇氨酸具有雙特異性而備受矚目。根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征和序列的相似性可分為典型的DUSP和非典型的DUSP。研究表明，現(xiàn)已知的大多數(shù)DUSP家族成員均作為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase phosphatases，MAPK)的負(fù)向調(diào)節(jié)劑參與細(xì)胞增殖、分化、代謝、基因轉(zhuǎn)錄、離子通道、細(xì)胞-細(xì)胞通信、免疫應(yīng)答等以及腫瘤的形成。 介于DUSP家族如此廣泛的功能，而其在滋養(yǎng)細(xì)胞的功能作用卻知之甚少，目前僅有一篇文獻(xiàn)報(bào)道DUSP9與胎盤(pán)發(fā)生發(fā)展及子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。我們擬利用PCR技術(shù)繪制DUSPs在正常早孕絨毛組織、正常晚孕胎盤(pán)組織及子癇前期胎盤(pán)組織中的動(dòng)態(tài)圖譜；結(jié)合先前研究及國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，篩選出最有意義的表達(dá)差異基因----DUSP5作為本次研究的目的基因。然后擬建立DUSP5過(guò)表達(dá)及其基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，深入探討DUSP5在滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡中的作用，以及究竟是通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和凋亡，為子癇前期發(fā)病機(jī)制的闡明奠定新的分子機(jī)制，也為發(fā)展新的臨床治療策略提供可行的靶點(diǎn)。 BeWo細(xì)胞系來(lái)自人絨毛膜癌組織，為人絨毛膜細(xì)胞癌株細(xì)胞系之一。相比于其它人絨毛膜細(xì)胞癌株JEG-3細(xì)胞系、JAR細(xì)胞系等，BeWo細(xì)胞系對(duì)外界刺激后，分泌人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)的能力和融合滋養(yǎng)細(xì)胞的能力與晚期妊娠絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞更為相似。故本研究選取該細(xì)胞株作為此次實(shí)驗(yàn)的體外細(xì)胞模型。 材料與方法 （一）DUSPs在正常早孕絨毛組織、正常晚孕胎盤(pán)組織和子癇前期胎盤(pán)組織中的表達(dá)差異 1．研究對(duì)象：2012年5月-2013年5月在我院確診并分娩的子癇前期患者的胎盤(pán)組織共20例為子癇前期組，同時(shí)期血壓正常因社會(huì)因素或骨盆異常而終止妊娠的正常晚期妊娠孕婦的胎盤(pán)組織20例為正常晚孕對(duì)照組，同時(shí)期無(wú)任何疾病或并發(fā)癥合并癥因非計(jì)劃妊娠于我院門(mén)診行人流的早孕婦女20例為正常早孕組。 2．實(shí)驗(yàn)方法：（1）采用半定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)DUSPs在三組組織中mRNA的表達(dá)，并繪制DUSPs在正常早孕絨毛組織、正常晚孕胎盤(pán)組織以及子癇前期胎盤(pán)組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜。（2）采用Western blot技術(shù)驗(yàn)證DUSP5蛋白在三組組織中的表達(dá)情況。 （二）DUSP5過(guò)表達(dá)及其基因沉默穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立 1．實(shí)驗(yàn)材料：正常的BeWo細(xì)胞株，DUSP5cDNA表達(dá)慢病毒載體、DUSP5RNAi慢病毒載體及其相應(yīng)的空病毒載體 2．實(shí)驗(yàn)方法：采用慢病毒介導(dǎo)方法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞株，擴(kuò)大培養(yǎng)后利用流式細(xì)胞儀分選陽(yáng)性細(xì)胞。采用qPCR和Western blot技術(shù)鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株是否過(guò)表達(dá)/沉默目的基因DUSP5。 （三）DUSP5對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖凋亡的影響及分子機(jī)制的研究 1．實(shí)驗(yàn)材料：正常的BeWo細(xì)胞株、DUSP5過(guò)表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株、DUSP5基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染了相應(yīng)的空病毒載體的BeWo細(xì)胞株 2．實(shí)驗(yàn)方法：采用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡情況；Western blot技術(shù)檢測(cè)p-ERK1/2、total-ERK1/2、p-p38、total-p38、p-JNK以及total-JNK的表達(dá)。 結(jié)果 （一）DUSPs在正常早孕組、正常晚孕對(duì)照組和子癇前期組中的表達(dá)差異 1. DUSPs各基因在正常早孕組中mRNA的表達(dá)量與正常晚孕對(duì)照組相比較，均顯著增高(P0.01)；而DUSPs在子癇前期組中的表達(dá)量與正常晚孕對(duì)照組相比較，呈現(xiàn)顯著的表達(dá)差異：其中DUSP1、DUSP2、DUSP3、DUSP4、DUSP5、DUSP6、DUSP9、DUSP10及DUSP23共9個(gè)基因在子癇前期組中的表達(dá)量顯著減少(P0.01)，而DUSP8、DUSP14和DUSP22基因在子癇前期組中的表達(dá)量顯著增高(P0.01)，余下的DUSP7和DUSP16在兩組間未見(jiàn)明顯差異。 2．DUSP5蛋白在正常早孕組顯著高表達(dá)，隨著妊娠的進(jìn)展在正常晚孕對(duì)照組中低表達(dá)，而在子癇前期組中顯著低表達(dá)甚至缺失。 （二）建立DUSP5過(guò)表達(dá)及其基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 1．經(jīng)流式細(xì)胞儀分選陽(yáng)性細(xì)胞后，熒光顯微鏡觀察見(jiàn)DUSP5過(guò)表達(dá)組及其相應(yīng)的空載體組具有明顯的紅色熒光，而DUSP5干擾組及其相應(yīng)的空載體組具有明顯的綠色熒光�？瞻讓�(duì)照組未見(jiàn)任何熒光表達(dá)。 2．在DUSP5過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，DUSP5過(guò)表達(dá)組中DUSP5mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于空白對(duì)照組和空載體組(P0.05)；在DUSP5干擾實(shí)驗(yàn)中，DUSP5干擾組中DUSP5mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于空白對(duì)照組和空載體組(P0.05)。兩組實(shí)驗(yàn)中的空白對(duì)照組和相應(yīng)的空載體組之間無(wú)顯著差異(P0.05)。 （三）DUSP5對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖凋亡的影響及分子機(jī)制的研究 1．CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果：相比于相應(yīng)的空載體組，DUSP5過(guò)表達(dá)組的O.D值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)，而DUSP5干擾組的O.D值顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡結(jié)果：相比于相應(yīng)的空載體組，DUSP5過(guò)表達(dá)組+DDP的早期細(xì)胞凋亡的百分?jǐn)?shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，而DUSP5干擾組早期細(xì)胞凋亡的百分?jǐn)?shù)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 3．DSUP5過(guò)表達(dá)后p-ERK1/2蛋白顯著降低(P0.01)，而DUSP5干擾后p-ERK1/2蛋白表達(dá)顯著升高(P0.01)。無(wú)論DUSP5過(guò)表達(dá)或是基因沉默，各組細(xì)胞中total-ERK1/2蛋白未見(jiàn)明顯變化。MAPK其他信號(hào)通路的指示蛋白p-p38、total-p38、p-JNK及total-JNK均未見(jiàn)明顯變化(P0.05)。 4．Western blot結(jié)果：DUSP5干擾組、空載體組和空白對(duì)照組分別與U0126共培后，p-ERK1/2蛋白的表達(dá)被抑制，而未與U0126共培養(yǎng)的相應(yīng)對(duì)照組中的p-ERK1/2蛋白正常表達(dá)，六組細(xì)胞中的total-ERK1/2均未見(jiàn)明顯變化。 5．流式細(xì)胞術(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果：DUSP5干擾組+U0126的早期細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)(4.49±0.67%)與DUSP5干擾組+DMSO(12.67±1.00%)相比較，顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。而早期細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)在空白對(duì)照組+U0126與空白對(duì)照組+DMSO中相比較以及空載體組+U0126與空載體組+DMSO中的相比較，均未見(jiàn)明顯變化(P0.05)。 結(jié)論 1．成功繪制了DUSPs在正常早孕絨毛組織、正常晚孕胎盤(pán)組織及子癇前期胎盤(pán)組織中的動(dòng)態(tài)圖譜，提示DUSPs與胎盤(pán)發(fā)生發(fā)育及子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。 2．成功建立DUSP5過(guò)表達(dá)及其基因沉默的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究DUSP5基因在滋養(yǎng)細(xì)胞中的功能作用提供良好的平臺(tái)。 3．(1) DUSP5過(guò)表達(dá)后可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、抑制其凋亡，而DUSP5干擾后則抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡，提示DUSP5基因與滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖凋亡密切相關(guān)。 (2) DUSP5過(guò)表達(dá)后顯著下調(diào)p-ERK1/2的蛋白水平，而DUSP5基因沉默后顯著上調(diào)p-ERK1/2的蛋白水平，而對(duì)total-ERK1/2蛋白無(wú)明顯作用；無(wú)論DUSP5過(guò)表達(dá)還是基因沉默，其對(duì)MAPK的其它信號(hào)通路的指示蛋白p-p38、total-p38、p-JNK及total-JNK均無(wú)明顯作用。提示DUSP5對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖凋亡的影響可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK ERK1/2信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。 (3)運(yùn)用ERK1/2特異性阻斷劑(U0126)有效地抑制ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，發(fā)現(xiàn)由DUSP5基因沉默引起的滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度凋亡作用被有效逆轉(zhuǎn)。據(jù)此，我們推斷DUSP5對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖凋亡的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R714.244

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 彭雯;劉藝;徐衛(wèi)娟;夏清華;;Role of Beclin 1-dependent Autophagy in Cardioprotection of Ischemic Preconditioning[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2013年01期

本文編號(hào)：2383271