【摘要】：子宮內(nèi)膜異位癥(簡稱內(nèi)異癥,Endomctriosis, EMS)是指具有生物學(xué)活性的子宮內(nèi)膜種植在子宮腔以外的組織中,主要臨床癥狀表現(xiàn)為痛經(jīng)、不孕、慢性盆腔痛及性交痛等,是育齡期婦女常見病、多發(fā)病之一。據(jù)報道其發(fā)病率高達(dá)3%～10%,且近年來有明顯增高的趨勢,其中30%-50%的內(nèi)異癥患者伴發(fā)不孕,30%-58%的不孕癥患者合并內(nèi)異癥,因而內(nèi)異癥對患者的身心健康及生活質(zhì)量有很大影響。此疾病雖是一種良性疾病,但卻具有轉(zhuǎn)移、種植等惡性行為。內(nèi)異癥的發(fā)病機理尚未研究清楚,但多項研究表明與正常婦女相比內(nèi)異癥患者血清、腹腔液中多種生化分子的表達(dá)均增高,如癌抗原CA-125、CA19-9、抗子宮內(nèi)膜抗體以及某些細(xì)胞因子等,同時內(nèi)異癥患者的在位子宮內(nèi)膜生化特性也發(fā)生了改變。目前子宮內(nèi)膜異位癥診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是腹腔鏡檢查結(jié)合病理學(xué)診斷,但可以代替腹腔鏡作為內(nèi)異癥診斷的簡單、無創(chuàng)的金標(biāo)準(zhǔn)仍缺乏,臨床有將上述表達(dá)變化的生物學(xué)分子用作輔助診斷手段,但它們的敏感性和特異性不高,而且診斷界值尚未確定,故僅具有臨床參考價值。 目前,治療方法有藥物治療、手術(shù)治療以及輔助生育等,其中藥物治療分為：性激素治療、中藥治療及其他治療；手術(shù)治療分為腹腔鏡下手術(shù)和開腹手術(shù)。手術(shù)方式包括：保守性手術(shù)即保留生育功能手術(shù),半根治性手術(shù)即保留卵巢功能手術(shù),根治性手術(shù)即全子宮切除與雙側(cè)附件切除術(shù)及病灶切除。盡管目前有各種治療方法與措施,但均未真正起到根治的作用,也未取得長久消除癥狀的效果。子宮內(nèi)膜異位癥經(jīng)典的治療模式為腹腔鏡手術(shù)+藥物治療。經(jīng)典的藥物主要是GnRHa、口服避孕藥、丹那唑、孕三烯酮等。它們療效確切,但是停止治療后數(shù)月往往復(fù)發(fā)。其中應(yīng)用較廣的是GnRHa,在疾病治療方面,縮小病灶、延緩復(fù)發(fā)、減輕盆腔疼痛等療效明顯,但藥理作用機制仍然不明確。 近年來,雖然有較多的研究對子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制進(jìn)行了報道,但是確切的機制我們?nèi)圆磺宄�。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制,目前尚未完全明確。其可能的發(fā)病機制是子宮內(nèi)膜隨經(jīng)血逆流進(jìn)入盆腔,在某些因素的作用下,機體不能清除逆流進(jìn)入盆腔的子宮內(nèi)膜,異位內(nèi)膜則在其種植、生長和轉(zhuǎn)移,其中必須通過粘附、侵襲、血管形成三個步驟來完成。目前發(fā)現(xiàn)如下幾種重要分子可能與發(fā)病有關(guān)：包括基質(zhì)金屬蛋白酶MMP、調(diào)亡抑制蛋白IAP家族成員的Survivin、血管內(nèi)皮生長因子VEGF等。它們的相互作用引起子宮內(nèi)膜在盆腹腔內(nèi)生長、發(fā)展,但具體的機制并不清楚。這也阻礙了我們制定更具針對性的治療子宮內(nèi)膜異位癥的有效方案。因此,繼續(xù)深入研究GnRHa;對治療子宮內(nèi)膜異位癥有效的機制具有重要意義,不僅可從側(cè)面了解內(nèi)異癥的致病機理,而且可以幫助我們探索尋找更有效的靶向治療藥物。目前,國內(nèi)外有GnRHa與蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究,但是尚無GnRHa治療前后在位內(nèi)膜在差異蛋白質(zhì)研究。 隨著人類基因組學(xué)研究的逐漸完成,生命科學(xué)的探索已經(jīng)進(jìn)入了后基因組時代,即蛋白質(zhì)組時代。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法有很多種,與傳統(tǒng)的研究手段相對,這些方法具有高通量、高效率、高準(zhǔn)確性等特點,目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多方面的研究。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法對內(nèi)異癥患者的血清以及在位子宮內(nèi)膜組織的蛋白質(zhì)表達(dá)變化進(jìn)行研究,以尋找與內(nèi)異癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì),這將有助于內(nèi)異癥的診斷以及復(fù)發(fā)的預(yù)測。 雙向凝膠電泳技術(shù)(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)于1975年首先由O'Farrell等創(chuàng)立,其原理是在相互垂直的兩個方向上,分別基于蛋白質(zhì)不同的等電點和分子量,運用等電聚焦電泳(isoelectric focusing, IEF)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)把復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分分離。該技術(shù)主要用于分離細(xì)胞或組織蛋白質(zhì)抽提物,構(gòu)建特定組織或細(xì)胞蛋白質(zhì)的“二維電泳圖譜“,分析特定條件下蛋白質(zhì)的表達(dá)狀況,進(jìn)行蛋白質(zhì)組差異比較。由于2-DE利用了蛋白質(zhì)兩個彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)對其進(jìn)行分離,因此分辨率非常高,一般能分辨到1000-3000個蛋白質(zhì)樣點。最好的膠可分離得到11000個左右的蛋白質(zhì)樣點。但這與龐大的蛋白質(zhì)組組分相比遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要,因此,樣品的制備和發(fā)展預(yù)分離方法是很有用的。然而,目前該技術(shù)仍是蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)。 二維電泳分離后的蛋白質(zhì)經(jīng)染色后顯示進(jìn)行鑒定,二維電泳中的顯色是一個重要步驟,常用的顯色方法有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染、熒光染色或同位素標(biāo)記等。傳統(tǒng)的染色方法銀染和考馬斯亮藍(lán)法染色,二者均有一定的弊端。銀染的線性范圍較窄,重復(fù)性差,考馬斯亮藍(lán)法染色靈敏度較低。最近研究發(fā)現(xiàn)熒光染色法,其靈敏度與銀染相似,但速度更快,線性范圍更寬,同時減少了對質(zhì)譜鑒定的影響。四種常用方法比較,銀染法是非放射性染色方法中最靈敏的,其靈敏度可達(dá)到lng甚至更低。但是靈敏的還是利用同位素標(biāo)記,20ppm的標(biāo)記蛋白就可通過其熒光或磷光的強度而測定。圖像分析也是二維電泳研究的重要方面。染色后可用圖像掃描儀、激光光密度儀、磷光或熒光測定儀等建立雙向凝膠電泳圖譜。此外,還要對不同組織、不同細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行比較,除掉凝膠圖譜的紋理和背景,找到表達(dá)上差異的蛋白質(zhì)點,確定有生物意義的蛋白質(zhì)。 差異凝膠電泳(differential in-gel electrophoresis, DIGE)用來檢測蛋白質(zhì)在兩種樣品中表達(dá)情況。對兩種樣品中的蛋白質(zhì)采用不同熒光標(biāo)記后混合,進(jìn)行雙向凝膠電泳,用熒光顯微鏡觀察,如果同一斑點顯示兩種熒光,說明一種蛋白質(zhì)同時在兩個樣品中表達(dá)；如果一個斑點只顯示一種熒光,該蛋白質(zhì)只在相應(yīng)的樣品中表達(dá)。差異凝膠電泳技術(shù)是雙向電泳技術(shù)的新發(fā)展,它最大的優(yōu)點是通過在同一塊凝膠上電泳,完全排除了由于電泳的重復(fù)性問題可能導(dǎo)致的誤差,大大提高了結(jié)果的可信度�？梢杂么朔N技術(shù)對不同樣品蛋白質(zhì)表達(dá)差異進(jìn)行分析,如對來自正常組織和癌變組織的樣品蛋白質(zhì)表達(dá)差異進(jìn)行分析。但是該項技術(shù)還是有一定弊端的,如該方法是將熒光染料標(biāo)記在賴氨酸殘基上的,對于不含賴氨酸的蛋白質(zhì)則難以使用,同時該方法所用的儀器及試劑較昂貴,較難以普遍使用。 2-D DIGE是在雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上引入了熒光標(biāo)記和內(nèi)標(biāo),通過與熒光染料高度匹配的熒光成像儀獲取三通道信號,以消除凝膠之間差異,從而檢測樣品間的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異。2-DDIGE是一種高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù),因此我們課題采用2-D DIGE對子宮內(nèi)膜異位癥患者在GnRHa治療前后在位內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)差異研究。以期從中篩選到與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生密切相關(guān)的蛋白并明確其作用機制,為闡明子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。 研究目的：分析GnRHa治療前后子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜蛋白表達(dá)的差異,分析其發(fā)生的原因并揭示相關(guān)發(fā)生機制,為闡明子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。 研究方法：本研究采集了GnRHa治療前后子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜組織,采用了TUNEL染色法和Western blot檢測組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況；用2-DDIGE檢測GnRHa治療前后子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜組織內(nèi)差異蛋白的表達(dá)情況,篩選有意義的蛋白,并應(yīng)用Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)對他們的表達(dá)水平進(jìn)行驗證；從子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜活檢組織中原代分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞,TUNEL染色法和Western blot檢測GnRHa對培養(yǎng)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用,并檢測GRP78的表達(dá)量；干擾和過表達(dá)GRP78的表達(dá)量檢測在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡率。 研究結(jié)果： 1.GnRHa治療誘導(dǎo)在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡 取GnRHa治療前后病人在位內(nèi)膜組織樣本,提取總蛋白后,用Western blot檢測caspase3的蛋白表達(dá)量。結(jié)果顯示,使用GnRHa后,caspase3表達(dá)量升高。相同組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟切片后,TUNEL和Hoechst共標(biāo)記檢測組織原位凋亡情況。結(jié)果顯示,使用GnRHa后,子宮內(nèi)膜異位癥病人在位內(nèi)膜組織凋亡細(xì)胞增加。以上結(jié)果說明,使用GnRHa可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡。 2.子宮內(nèi)膜異位癥病人GnRHa治療前后在位內(nèi)膜蛋白差異表達(dá)的研究 取GnRHa治療前后病人的在位內(nèi)膜組織樣本,應(yīng)用2-D DIGE對組織蛋白的差異表達(dá)情況進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)55個差異表達(dá)的蛋白,其中26個蛋白經(jīng)過MALDI-TOF/TOF MS鑒定,包括12個上調(diào)蛋白和14個下調(diào)蛋白。按功能可分為,6個分泌蛋白、4個細(xì)胞骨架蛋白、4個分子伴侶、4個蛋白具有催化活性、2個蛋白參與氧化還原反應(yīng)、2個是細(xì)胞膜蛋白和其他蛋白。應(yīng)用Western blot和免疫組化驗證由2-D DIGE篩選出的四個GnRHa治療前后子宮內(nèi)膜異位癥病人在位內(nèi)膜組織中差異蛋白的表達(dá)。這四個蛋白是：GRP78、 PPA1、EFHA2和TGM2。GAPDH作為內(nèi)參,Western blot檢測子宮內(nèi)膜異位癥病人在位內(nèi)膜組織中GRP78、PPA1、EFHA2和TGM2的蛋白水平。結(jié)果顯示GRP78和PPA1在子宮內(nèi)膜異位癥患者治療后下調(diào),而EFHA2和TGM2則上調(diào)。用免疫組織化學(xué)法檢測子宮內(nèi)膜異位癥病人在位內(nèi)膜組織切片中GRP78、PPA1EFHA2和TGM2的表達(dá),結(jié)果與Western blot檢測結(jié)果相同。GRP78和PPA1在子宮內(nèi)膜異位癥患者治療后下調(diào),而EFHA2和TGM2則上調(diào)。 3. GnRHa誘導(dǎo)體外分離的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡檢測 原代分離培養(yǎng)來自子宮內(nèi)膜異位癥病人的在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞,TUNEL和Western blot檢測caspase3在醋酸亮丙瑞林處理后細(xì)胞凋亡檢測。結(jié)果顯示,原代分離培養(yǎng)來自子宮內(nèi)膜異位癥病人的在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞經(jīng)醋酸亮丙瑞林處理后,TUNEL染色陽性細(xì)胞增加。Western blot檢測醋酸亮丙瑞林處理的原代分離培養(yǎng)來自子宮內(nèi)膜異位癥病人的在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞caspase3表達(dá)量,顯示處理后caspase升高。提示,GnRHa可以誘導(dǎo)原代分離培養(yǎng)來自子宮內(nèi)膜異位癥病人的在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。 4.GRP78對GnRHa處理后在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的影響 Western blot檢測GnRHa對原代分離培養(yǎng)來自子宮內(nèi)膜異位癥病人在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞的GRP78表達(dá)情況。結(jié)果顯示,GnRHa;對子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的GRP78有下調(diào)作用,說明GRP78參與GnRHa誘導(dǎo)在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控。應(yīng)用siRNA干擾原代培養(yǎng)的在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞表達(dá)GRP78,再用醋酸亮丙瑞林處理后,細(xì)胞凋亡率增加；構(gòu)建GRP78過表達(dá)載體,再用醋酸亮丙瑞林處理后細(xì)胞凋亡率減低。從正反面進(jìn)一步驗證了GRP78參與GnRHa;對子宮內(nèi)膜異位癥病人在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)反應(yīng)。 結(jié)論： (1)子宮內(nèi)膜異位癥患者GnRHa治療后可誘導(dǎo)在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡； (2)2-D DIGE檢測子宮內(nèi)膜異位癥病人GnRHa治療前后在位內(nèi)膜的差異蛋白表達(dá)并進(jìn)行驗證,結(jié)果有55個差異表達(dá)的蛋白,其中GRP78和PPAl在子宮內(nèi)膜異位癥患者治療后下調(diào),而EFHA2和TGM2則上調(diào)； (3) GnRHa可以誘導(dǎo)原代分離培養(yǎng)的來自子宮內(nèi)膜異位癥病人的在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡； (4)對GRP78調(diào)節(jié)患者GnRHa治療后誘導(dǎo)在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)GRP78可以負(fù)向調(diào)控GnRHa誘導(dǎo)的在位內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R711.71

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2383079