【摘要】：卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是原發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)發(fā)展的終末階段,此時原始卵泡池處于耗竭狀態(tài),并且此種耗竭狀態(tài)是不可逆的,臨床上表現(xiàn)為閉經(jīng)、不孕以及骨質疏松、潮熱多汗等絕經(jīng)期癥狀。POF在臨床上并不少見,有調查表明30歲以內(nèi)女性POF的發(fā)病率約為千分之一,40歲以內(nèi)的發(fā)病率約為百分之一。POF的相關病因多且復雜,目前的研究表明,遺傳因素、免疫因素、代謝因素、醫(yī)源性損傷、病毒感染和其他環(huán)境因素等都可能導致卵巢早衰的發(fā)生。但是,截至目前為止,卵巢早衰的確切的發(fā)病機制尚未完全闡明。目前發(fā)現(xiàn)多個可能與POF發(fā)病有關的基因都與凋亡過程相關。例如MLH3基因突變導致減數(shù)分裂不能正常進行,使異常卵母細胞出現(xiàn)了快速凋亡;PGRMC1基因錯義突變會損傷卵巢發(fā)育中孕酮的抗凋亡作用,使得卵泡的過早丟失,最終導致POF。根據(jù)電泳的方法發(fā)現(xiàn)細胞游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)與凋亡細胞形成的條帶相一致,并且T淋巴細胞等活性細胞DNA的主動釋放也會形成相似的條帶。由此表明,cfDNA可能主要來源于細胞凋亡和活性細胞新合成DNA的主動釋放。因此,我們以cfDNA為切入點探究細胞凋亡是否影響POF的發(fā)病。除此之外,DNA甲基化是生物體內(nèi)一種不可或缺的多種酶參與的表觀遺傳學調控方式。高等的真核生物可以通過DNA甲基化狀態(tài)的改變來調控基因是否表達以及表達的程度。研究表明,多種疾病中普遍存在DNA的異常甲基化的現(xiàn)象,尤其是在腫瘤中,這可能是腫瘤的發(fā)病中最早出現(xiàn)的改變。cfDNA作為不同于細胞內(nèi)DNA的遺傳物質,有其特有的來源與生物學特性。其中cfDNA甲基化特性可能成為較多相關疾病的診斷靶標。現(xiàn)有的多項研究表明,在多種疾病中cfDNA相關基因的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變,并且已經(jīng)開始探討將其作為特異性診斷指標應用于臨床實踐的可能性。故從cfDNA特異基因甲基化角度來探究POF發(fā)病機制,對卵巢早衰的早診斷、早治療以及預后判斷有重大的意義。目的通過探究POF患者血漿中cfDNA的含量及完整性的特征以及cfDNA的甲基化的特點,為POF發(fā)病機制的研究提供新的角度。方法本研究的研究對象為本中心被診斷為卵巢早衰(POF)的患者,研究樣品為患者的血漿細胞游離DNA,以卵巢功能正常的女性為對照。采用實時熒光定量PCR(Real time-qPCR,RT-qPCR)絕對定量法檢測細胞游離DNA的含量,通過計算不同片段長度細胞游離DNA的比例得到細胞游離DNA的完整性指數(shù)。采用甲基化芯片技術檢測血漿cfDNA的甲基化狀態(tài),再用GO分析法探索差異甲基化位點對應基因的聚類信息。結果通過Real time-qPCR的方法,用引物ALU115進行Real-time PCR得到的CT值所計算的到的cfDNA濃度,代表血漿中全部的cfDNA含量,引物ALU247進行Real time-qPCR得到的CT值所計算的到的cfDNA濃度,則代表血漿中較大片段的cfDNA含量。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),POF組的血漿cfDNA濃度高于對照組(9.76ng/μl vs.3.73ng/μl,p0.001),POF組的血漿cfDNA完整性低于對照組(8.35%vs.22.41%,p0.001)。POF組和對照組患者的血清cfDNA經(jīng)過重亞硫酸鹽轉化后,用BeadChip Array Inf Methyl 8 Sample Beadchip甲基化芯片對其進行甲基化分析,發(fā)現(xiàn)有127724個位點的甲基化水平存在顯著差異。POF組和對照組中差異甲基化位點分布在CpG高密度區(qū)和CpG中密度區(qū)比例分別為39.52%和43.68%。對基因組功能區(qū)分析發(fā)現(xiàn),啟動子區(qū)(TSS1500、TSS200及1st Exon)的差異甲基化位點占36.66%。用DAVID網(wǎng)站對POF組和對照組中差異甲基化位點對應的基因進行GO分析,包括細胞組分、分子功能和生物過程。差異甲基化位點所在基因主要定位于細胞質、質膜、胞質溶膠、胞質外體等細胞組分;具有蛋白結合、ATP結合和RNA結合和GTPase激活劑活性等分子功能;參與正向調節(jié)GTPase活性、蛋白磷酸化、細胞內(nèi)信號轉導及正向調節(jié)凋亡等生物過程。利用KEGG分析差異甲基化位點所在基因參與的信號通路。結果顯示,POF組和對照組相比,差異甲基化位點所在基因主要參與MAPK信號通路、內(nèi)吞作用以及雌激素信號通路、孕激素介導的卵母細胞成熟及GnRH信號通路等。結論1.卵巢早衰患者血漿中cfDNA的含量增加,而完整性降低,可能是由于細胞凋亡增加所導致的。2.卵巢早衰患者血漿中cfDNA的差異甲基化位點富集于對細胞凋亡起調控作用的KEGG通路,以及雌激素信號通路、孕激素介導的卵母細胞成熟及GnRH信號通路等與卵泡發(fā)育密切相關的信號通路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R711.75

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