【摘要】：背景與目的 人類育齡婦女的卵母細(xì)胞發(fā)育成熟時,卵母細(xì)胞周圍包裹大量的顆粒細(xì)胞稱之為卵冠丘復(fù)合體(由卵母細(xì)胞、放射冠細(xì)胞和外層的顆粒細(xì)胞組成)。在輔助生殖技術(shù)中,當(dāng)女方的卵泡發(fā)育成熟后,在陰道B超的引導(dǎo)下,將卵冠丘復(fù)合體取出體外,卵冠丘復(fù)合體取出體外后受精方式有兩種,一種是常規(guī)的體外受精-胚胎移植技術(shù)(In vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET),即女方的卵冠丘復(fù)合體取出體外當(dāng)天,男方取出精子,當(dāng)精子密度≥2×107/ml,前向運(yùn)動精子≥25%,正常形態(tài)精子≥4%,可以按一個卵冠丘復(fù)合體加1萬條精子的比例共同培養(yǎng),讓精子和卵母細(xì)胞自由結(jié)合受精；另一種受精方式為單精子卵母細(xì)胞漿內(nèi)注射技術(shù)(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI),即當(dāng)男方精子質(zhì)量不符合上述標(biāo)準(zhǔn)時,我們將卵冠丘復(fù)合體的放射冠細(xì)胞和外層顆粒細(xì)胞拆除,形成僅透明帶包裹的卵母細(xì)胞,采用顯微注射技術(shù)將單個精子直接注射到卵母細(xì)胞漿內(nèi)輔助受精。 雖然ICSI技術(shù)已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用,但采用顯微注射針將精子注射到卵母細(xì)胞內(nèi)的技術(shù)操作對卵母細(xì)胞細(xì)胞具有創(chuàng)傷性,還具有潛在的將DNA異常的精子或外源異常DNA注射到卵母細(xì)胞內(nèi)而傳遞給下一代的風(fēng)險(xiǎn),所以我國衛(wèi)生部的《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》對ICSI技術(shù)的嚴(yán)格的限制于重度少、弱、畸形精子癥等。 臨床實(shí)踐中,人類卵母細(xì)胞的冷凍保存時通常將放射冠細(xì)胞和外層顆粒細(xì)胞全部拆除,形成僅透明帶包裹的裸卵,將裸卵經(jīng)玻璃化冷凍解凍后,采用ICSI方式受精,因?yàn)槿藗冋J(rèn)為卵母細(xì)胞玻璃化冷凍解凍后透明帶硬化、同時導(dǎo)致卵母細(xì)胞漿內(nèi)的皮質(zhì)顆粒提前釋放,進(jìn)一步導(dǎo)致卵母細(xì)胞膜和透明帶的硬化,從而阻止精子進(jìn)入卵母細(xì)胞內(nèi)受精,必需借助ICSI技術(shù)才能保證正常受精。 那么在臨床實(shí)踐中,需要進(jìn)行卵母細(xì)胞冷凍保存的夫婦,當(dāng)男方的精液參數(shù)符合做常規(guī)的IVF方式受精時,解凍后的卵母細(xì)胞是否必需采用ICSI方式受精?如果保留卵母細(xì)胞周圍的放射冠細(xì)胞能否采用常規(guī)的IVF方式受精? 本研究就是探討在人類卵冠丘復(fù)合體中放射冠細(xì)胞在受精中作用及玻璃化凍融的卵母細(xì)胞解凍采用常規(guī)IVF方式受精的可行性。 材料和方法 卵冠丘復(fù)合體是卵母細(xì)胞、放射冠細(xì)胞和外層顆粒細(xì)胞共同構(gòu)成,外層顆粒細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松,細(xì)胞之間充斥大量外基質(zhì),稱之為卵丘細(xì)胞(cumulus oophorus cells, COCs);緊密包裹在卵母細(xì)胞透明帶周圍的內(nèi)層顆粒細(xì)胞又稱之為放射冠細(xì)胞(Corona radiata cells, CRCs)。 在進(jìn)行ICSI操作或卵母細(xì)胞冷凍保存時,需要用透明質(zhì)酸酶將COCs和CRCs消化,再用拉細(xì)的毛細(xì)管將COCs和CRCs拆除,形成的僅有透明帶包裹的裸卵來用于ICSI受精或冷凍保存?zhèn)溆?COCs和CRCs是廢棄不用的體細(xì)胞。本研究就是利用僅有透明帶包裹的裸卵結(jié)合廢棄不用的COCs和CRCs來研究CRCs在人類卵母細(xì)胞受精中作用。探討玻璃化凍融的卵母細(xì)胞采用常規(guī)體IVF方式受精的可行性,研究方法如下： 1、采用蛋白酶E0.1%(w/v)PBS液中進(jìn)行透明帶消化實(shí)驗(yàn).,比較新鮮的卵母細(xì)胞和玻璃化凍融卵母細(xì)胞透明帶消化所需要的平均時間,分析卵母細(xì)胞玻璃化凍融后是否存在透明帶硬化。 2、采用透射電鏡觀察新鮮的卵母細(xì)胞和玻璃化凍融卵母細(xì)胞的皮質(zhì)顆粒等超微結(jié)構(gòu),判斷卵母細(xì)胞玻璃化凍融后是否存在皮質(zhì)顆粒提前釋放現(xiàn)象。 3、有／無CRCs包裹的新鮮卵母細(xì)胞以及有／無CRCs包裹的凍融卵母細(xì)胞的和精子在體外受精(IVF),觀察各組的受精情況。 4、CRCs包裹的卵母細(xì)胞凍融后,常規(guī)的IVF受精率及臨床妊娠結(jié)果觀察。 結(jié)果 透明帶硬化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,人類卵母細(xì)胞透明帶在蛋白酶E0.1%(w/v)PBS液中消化所需要的平均時間為868.00+11.76秒,保留CRCs玻璃化冷凍組和無CRCs玻璃化冷凍組透明帶消化所需的平均時間分別為870.67+12.15秒和868.50+15.35秒,相互之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但和陽性對照組(多精受精卵母細(xì)胞)所需的平均時間(1083.17+31.55秒)具有明顯差異(P0.001)。 卵母細(xì)胞玻璃化凍融后的透射電鏡結(jié)果顯示,對照組和有／無CRCs包裹透明帶的卵母細(xì)胞凍融后,其形態(tài)、透明帶的電子云密度、線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和紡錘體等超微結(jié)構(gòu)沒有明顯的差異。卵細(xì)胞膜下可見皮質(zhì)顆粒均勻排布。在對照組、無CRCs包裹的卵母細(xì)胞凍融組和有CRCs包裹的凍融組每10平方微米的皮質(zhì)顆粒數(shù)分別為8.93±0.28,7.84±0.47和7.93±0.36個,和對照組相比P0.05(n=6)。并沒有證據(jù)表明皮質(zhì)顆粒提前釋放。 有CRCs包裹的卵母細(xì)胞玻璃化冷凍解凍后采用常規(guī)的體外受精方式受精及胚胎發(fā)育情況顯示,無CRCs包裹的卵母細(xì)胞組受精率18.8%(9/48),低于有CRCs包裹的卵母細(xì)胞組受精率77.1%(37/48),兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。受精后的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均沒有差異。在新鮮卵母細(xì)胞的對照中具有相似的結(jié)果,無CRCs包裹的新鮮卵母細(xì)胞組受精率22.6(12/53),低于有CRCs包裹的新鮮卵母細(xì)胞組受精率74.1(40/54),兩者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。受精后的卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均沒有差異。在有CRCs包裹的新鮮卵母細(xì)胞組和凍融卵母細(xì)胞組分別有8例患者接受了胚胎移植,分別獲得3例臨床妊娠,種植率分別為37.5(6/16)和31.3(5/16)。兩者之間沒有差別。 15例CRCs包裹的卵母細(xì)胞凍融的臨床應(yīng)用結(jié)果顯示,兩種玻璃化冷凍液冷凍保存卵母細(xì)胞解凍后的受精率分別為73.8和73.6%,,臨床妊娠率分別為50.0和44.4%。 結(jié)論 1、不論新鮮的卵母細(xì)胞或凍融的卵母細(xì)胞,CRCs包裹可明顯改善卵母細(xì)胞受精結(jié)局。 2、有CRCs包裹的卵母細(xì)胞凍融后,可以采用常規(guī)的體外受精方式受精 3、人類卵母細(xì)胞玻璃化凍融后,沒有出現(xiàn)透明帶硬化現(xiàn)象 4、有CRCs包裹的卵母細(xì)胞凍融后,采用常規(guī)的體外受精方式受精形成的胚胎移植可以獲得和新鮮胚胎移植相似的臨床妊娠率。 背景與目的 在卵泡發(fā)生過程中,卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞根據(jù)與卵母細(xì)胞的距離和形態(tài)可以分為放射冠細(xì)胞和卵丘細(xì)胞,兩者功能類似但又有所區(qū)別,共同參與卵母細(xì)胞和卵泡的發(fā)生、發(fā)育以及成熟等卵巢中的關(guān)鍵事件和功能。研究人類卵巢顆粒細(xì)胞的基因表達(dá)和調(diào)控對于認(rèn)識卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能和研究影響體外受精胚胎移植(in vitro fertilizaiton, IVF)的妊娠成功的因素是非常有益的。然而,關(guān)于人類卵巢顆粒細(xì)胞基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控水平的研究尚少。近年來,miRNA在人類卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控功能引起了廣泛的關(guān)注。本研究的目的分析人類正常卵巢內(nèi)的放射冠細(xì)胞(corona radiata cells, CRCs)和卵丘細(xì)胞(cumulus oophorus cells, COCs) microRNAs (miRNAs)的表達(dá)譜,并分析miRNA對卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟的影響。 材料和方法 不孕癥患者在接受體外受精-胚胎移植助孕的過程中,女方采用促排卵藥物促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟后,在陰道超聲引導(dǎo)下,穿刺獲取卵冠丘復(fù)合體,分離其中的CRCs和COCs,對這兩種細(xì)胞的miRNA進(jìn)行深度測序獲取CRCs和COCs的miRNA表達(dá)譜(包括新發(fā)現(xiàn)的miRNA),并分析差異表達(dá)的miRNA。利用生物信息學(xué)軟件對差異表達(dá)miRNA的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測,進(jìn)而運(yùn)用GO注釋分析和KEGG信號通路富集分析等方法對其潛在的下游調(diào)控通路進(jìn)行富集和篩選。在預(yù)測和篩選的基礎(chǔ)上,運(yùn)用實(shí)時定量RT-PCR、Western Blot和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)對兩種細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA的表達(dá)及其下游靶標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。 結(jié)果 深度測序結(jié)果顯示,在CRCs和COCs分別有785和799個已注釋的miRNAs被確認(rèn)。在這兩種細(xì)胞中共有6個高表達(dá)的Novel miRNA被檢測到。在CRCs和COCs中共有72個已注釋的miRNAs存在差異表達(dá)。采用定量real-time PCR分別對已注釋的miRNAs、差異表達(dá)miRNAs和Novel miRNA進(jìn)行了定量檢測。證明己注釋的miRNAs、差異表達(dá)miRNAs和Novel miRNA的新一代測序結(jié)果是可靠的。在顆粒細(xì)胞中廣泛參與生物進(jìn)程的let-7家族的miRNAs伴隨有大量的miRNA編輯。GO注釋分析和KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn),在CRCs和COCs中差異表達(dá)的miRNAs參與氨基酸,能量代謝,免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)控、細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)育和調(diào)節(jié)等多條信號通路。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),miR-4286可能通過調(diào)控SLC2A1(GLUT1) mRNA和蛋白的表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的運(yùn)輸和代謝。利用定量RT-PCR.Western Blot等方法證實(shí),miR-4286和SLC2A1在CRCs和COCs中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。同時結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)等方法發(fā)現(xiàn)miR-4286可以直接與SLC2A1的,mRNA相結(jié)合,并導(dǎo)致其降解,從而最終影響SLC2A1的表達(dá)和功能。 結(jié)論 CRC和COC這兩種顆粒細(xì)胞中72種差異表達(dá)的miRNA可能通過影響能量代謝,氨基酸代謝、免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)控、細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)育和調(diào)節(jié)等多條信號通路參與了卵母細(xì)胞和卵泡的發(fā)生與發(fā)育。在CRCs中高表達(dá)的miR-4286可能通過抑制SLC2A1(GLUT1) mRNA和蛋白的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控CRCs內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),從而影響CRCs對葡萄糖的利用和轉(zhuǎn)化。提示卵泡和卵母細(xì)胞發(fā)育的過程中,卵母細(xì)胞所需的能量主要由COCs,而不是CRCs,通過葡萄糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸來提供�？傊�,通過在CRCs和COCs中miRNAs表達(dá)譜、兩種細(xì)胞差異表達(dá)的miRNAs及其靶通路的預(yù)測,為卵泡和卵母細(xì)胞的發(fā)育的研究提供了一種有用的方法,為進(jìn)一步研究卵巢早衰、多囊卵巢綜合癥等卵泡發(fā)育障礙提供一個有用的技術(shù)平臺。也為未來理想地控制卵泡的發(fā)生和女性生殖、減少生殖相關(guān)疾病的發(fā)生以及延緩絕經(jīng)期到來積累新知識、提出新理論、尋找新思路、建立新方法,為提高人口質(zhì)量、生活質(zhì)量、促進(jìn)人類健康做出貢獻(xiàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2352105