【摘要】：背景 細胞外基質(Extra-cellular matrix, ECM)是由細胞合成并分泌到胞外、分布于細胞表面或細胞之間的大分子,起到支撐、連接、保護作用,并通過多種信號傳導系統(tǒng)全方位影響細胞形態(tài)、代謝、增殖、分化等。組成腫瘤ECM骨架最主要的物質是膠原蛋白,正常的ECM結構呈現(xiàn)動態(tài)平衡,組成成分受到嚴格控制,而腫瘤ECM則呈現(xiàn)失調的狀態(tài)。近年來,腫瘤進展過程中膠原蛋白的成分和結構的變化成為研究的熱點,多項研究發(fā)現(xiàn),腫瘤侵襲過程中,ECM中的膠原蛋白可通過一系列酶的作用發(fā)生交聯(lián)結構和形態(tài)的改變,最終促使腫瘤侵襲和轉移,稱為膠原纖維重構。在重構過程中,膠原纖維的質和量的變化,主要體現(xiàn)在膠原蛋白降解及再次沉積,再次沉積的膠原纖維交聯(lián)增多、硬度增加。此外,重構的膠原纖維排列形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化,由包繞癌灶卷曲形態(tài)變?yōu)榇┻^癌灶的線性形態(tài),腫瘤細胞可在此重構的線性膠原纖維上快速移動,導致侵襲性大大增強,有研究者將此穿過癌巢的膠原纖維稱為腫瘤侵襲“高速公路”。Provenzano等將這種重構的膠原纖維定義為腫瘤相關膠原纖維形態(tài)(Tumor-associated collagen signature, TACS), TACS共分為3個階段,TACS-3階段的膠原纖維即為ECM重構后的膠原纖維形態(tài),Conklin等也報道了TACS-3形態(tài)的出現(xiàn)可作為乳腺癌患者的獨立不良預后指標。此外,腫瘤ECM內的膠原纖維還可分泌趨化因子募集炎癥細胞浸潤,通過分泌多種與腫瘤增殖相關細胞因子,例如白介素-1β (IL-1β)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)及E選擇素,促進腫瘤血管生成、細胞粘附、誘導EMT現(xiàn)象等多個方面提升腫瘤侵襲性。綜上所述,腫瘤ECM中的發(fā)生重構的膠原纖維從多個方面促進了腫瘤的侵襲、轉移。 Plod2是一種功能性的酶,位于細胞質的粗面內質網,參與膠原蛋白的翻譯后修飾,主要功能是催化膠原蛋白端肽區(qū)賴氨酸殘基羥基化。發(fā)生賴氨酸羥基化的膠原蛋白在分泌出細胞外后可相互交聯(lián)形成穩(wěn)定結構的羥賴氨酸吡啶鏈,相反,未發(fā)生羥基化的膠原蛋白所形成的纖維交聯(lián)不穩(wěn)定,容易降解。當細胞內Plod2表達明顯升高時,由于羥賴氨酸吡啶鏈生成增加,將導致膠原纖維過度沉積,多項研究報道了纖維化疾病與Plod2過表達相關。前文已述,膠原纖維的重構在促進腫瘤侵襲性起了非常重要的作用,由此我們推測Plod2可能參與了腫瘤中的ECM重構過程,促進腫瘤ECM膠原纖維沉積,并通過形成癌巢內TACS-3形態(tài)膠原纖維提升了腫瘤細胞的侵襲性。目前,國內外大部分關于Plod2與惡性腫瘤方面的研究僅僅涉及到基因芯片檢測水平,真正對Plod2與腫瘤機制方面的探討極少。Gilkes等在Plod2與在乳腺癌的研究中,發(fā)現(xiàn)Plod2高表達與腫瘤患者高死亡率相關,對于癌組織的膠原纖維形成必不可少,為驗證Plod2促進腫瘤侵襲的功能,分別將乳腺癌細胞和沉默Plod2表達的乳腺癌細胞注射入裸鼠體內成瘤,沉默Plod2表達的移植瘤組織硬度低,膠原纖維沉積量明顯減少,且淋巴結轉移灶及肺部轉移灶的數(shù)量明顯減少,提示了Plod2與腫瘤侵襲性的密切聯(lián)系。Eisinger-Mathason等在未分化肉瘤的研究中進一步發(fā)現(xiàn)Plod2抑制劑米諾地爾能夠減少癌巢內膠原纖維沉積,并減少了腫瘤肺內轉移灶的數(shù)量。 關于Plod2與宮頸癌的報道較少,Rajkumar等運用基因芯片技術分析了28例宮頸癌、4例CIN3/原位癌、4例CIN1/CIN2以及5例正常宮頸組織的基因表達差異,發(fā)現(xiàn)其中包括了Plod2在內的基因在宮頸癌中高表達。然而,Plod2蛋白在宮頸癌組織中是否高表達?能否作為宮頸癌患者有效預測指標?能否成為預防腫瘤轉移的新的治療靶位?這些疑問尚有待研究。 HIF-1αa促進宮頸癌侵襲性增加已經得到共識,但其現(xiàn)象下的機制并不清楚。多項研究證實,HIF-1α可上調Plod2表達。因此我們猜想在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中,HIF-1α可能通過誘導了Plod2表達升高,繼而改變膠原纖維交聯(lián)模式并最終通過ECM重構促進宮頸癌侵襲性改變。我們所進行的研究,均圍繞上述猜想而展開。 研究方法 1、檢測PIod2在宮頸癌及癌旁組織的表達情況 本研究需新鮮組織標本均來自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院婦產科,共11例宮頸癌、對應的癌旁組織手術標本。RT-PCR檢測11例宮頸癌與癌旁組織Plod2表達差異。 2、免疫組化檢測宮頸癌癌組織及對應癌旁組織中Plod2、HIF-1α的表達 收集南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院2005年1月至2012年1月共164例宮頸癌標本及13例宮頸慢性不典型增生石蠟標本,其中164例標本中有75例對應的癌旁組織。通過免疫組化法檢測組織中Plod2、HIF-1α蛋白表達,根據(jù)染色的范圍及染色強度評分,分析Plod2、HIF-1α表達情況與宮頸癌患者臨床病理學特征之間的聯(lián)系,運用Spearman統(tǒng)計方法法分析HIF-1α與Plod2之間的關系。采用Kaplan-Meier法進行單因素分析,Hazard ration (HR)采用Cox模型計算得出。 3、檢測宮頸癌組織中膠原蛋白含量,分析Plod2表達與膠原蛋白沉積的關系 1)從上述Plod2高表達的新鮮宮頸癌標本中選取6對癌與癌旁組織,Western blot檢測宮頸癌與癌旁組織一型膠原蛋白(Co1-Ⅰ)的表達差異。 2)將164例患者根據(jù)Plod2表達水平高低分為高表達組和低表達組,并將病理切片進行天狼星紅染色,觀察Plod2不同表達水平癌巢內膠原纖維形態(tài),運用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件分析膠原纖維在沉積在整個視野內所占百分比。分別計算兩組平均膠原纖維沉積百分比,通過獨立樣本t檢驗比較兩組平均值。 4、檢測米諾地爾對Siha細胞Plod2表達的抑制作用 Plod2在宮頸癌細胞株的表達情況。 標本來源：宮頸癌細胞株HeLa、SiHa由南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院腫瘤科實驗室保存,用加入了10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)。2例正常宮頸組織來自南方醫(yī)院婦產科。 Western blot檢測Plod2在宮頸癌細胞株的表達,2例正常宮頸組織作為對照。 2)培養(yǎng)宮頸癌Siha細胞株,用不同濃度米諾地爾作用Siha細胞后,光鏡下觀察細胞形態(tài),Western blot檢測Plod2的表達；同一濃度作用Siha細胞,不同時間點收集細胞,Western blot檢測Plod2的表達；劃痕實驗檢測經米諾地爾作用后細胞遷移能力的變化。 研究結果 1. Plod2在新鮮宮頸癌標本中的表達情況 用RT-PCR檢測方法檢測11對宮頸癌及癌旁組織,發(fā)現(xiàn)9例癌組織的Plod2轉錄水平的表達高于對應的癌旁組織,比值均為2倍以上。 2.免疫組化檢測Plod2、HIF-1α在宮頸癌組織中的表達 (1) Plod2在164例宮頸癌標本中陽性表達率為60.4%,其中75例同時具有癌與癌旁組織的標本中Plod2陽性表達率分別為42.7%,0%；13例宮頸上皮瘤樣變僅一例弱陽性。 (2)Plod2的高表達與宮頸癌的脈管癌栓(P=0.007)、深肌層浸潤(P=0.001)、腫瘤大小(P=0.018)、盆腔淋巴結轉移(P=0.025)密切相關,與其年齡、分期、病理分類、病理分級無關。 (3)HIF-la的高表達與宮頸癌的腫瘤大小(P=0.024)、深肌層浸潤(P=0.016)密切相關,與患者年齡、分期、病理分類、病理分級、淋巴結轉移無關。 (4) Spearman相關性分析提示,Plod2與HIF-la成正相關,相關系數(shù)r=0.400,P0.001。 (5)Cox生存分析提示Plod2為宮頸癌患者的獨立預后因素(P=0.004)。 3. Plod2表達與宮頸癌組織膠原蛋白含量之間的關系 1) Western blot檢測發(fā)現(xiàn)6對癌與癌旁組織中,一型膠原(COL-1)在癌組織的表達高于對應的癌旁組織。 2)對164例宮頸癌切片進行天狼星紅染色,發(fā)現(xiàn)Plod2高表達組的癌巢內的癌細胞沿膠原纖維走形分布,結構松散,膠原纖維形態(tài)致密,垂直穿過癌巢；Plod2低表達的癌巢內癌細胞排列緊密,膠原沉積較少,主要呈現(xiàn)包繞癌巢周圍的形態(tài)。 3)利用IPP圖像分析軟件得出Plod2高表達組平均膠原纖維沉積百分比為10.93±6.83(%),Plod2低表達組平均膠原纖維沉積百分比為5.59±4.89(%),兩組膠原纖維沉積百分比的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001)。 4.米諾地爾對Siha細胞Plod2的抑制作用 1)宮頸癌細胞株HeLa、SiHa中Plod2在蛋白水平表達明顯高于正常宮頸上皮組織。 2) Siha細胞株經米諾地爾濃度梯度以及時間梯度作用后,Plod2表達均有下降,細胞形態(tài)由梭型變?yōu)闄E圓且偽足減少；此外,經米諾地爾作用,Siha細胞遷移能力明顯下降。 結論 1) Plod2在宮頸癌細胞及組織中高表達,其高表達與宮頸癌的侵襲性升高密切相關,是宮頸癌患者獨立不良預后因子； 2)宮頸癌侵襲性的升高可能通過HIF-1α、Plod2途徑,促進腫瘤ECM膠原纖維重構實現(xiàn)； 3) Plod2有可能成為判斷宮頸癌患者進展及預后分子標志物,為宮頸癌的預后判斷及治療提供了新的分子靶點。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

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本文編號：2325394