【摘要】：背景 細(xì)胞外基質(zhì)(Extra-cellular matrix, ECM)是由細(xì)胞合成并分泌到胞外、分布于細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子,起到支撐、連接、保護(hù)作用,并通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)全方位影響細(xì)胞形態(tài)、代謝、增殖、分化等。組成腫瘤ECM骨架最主要的物質(zhì)是膠原蛋白,正常的ECM結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)平衡,組成成分受到嚴(yán)格控制,而腫瘤ECM則呈現(xiàn)失調(diào)的狀態(tài)。近年來(lái),腫瘤進(jìn)展過(guò)程中膠原蛋白的成分和結(jié)構(gòu)的變化成為研究的熱點(diǎn),多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤侵襲過(guò)程中,ECM中的膠原蛋白可通過(guò)一系列酶的作用發(fā)生交聯(lián)結(jié)構(gòu)和形態(tài)的改變,最終促使腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,稱(chēng)為膠原纖維重構(gòu)。在重構(gòu)過(guò)程中,膠原纖維的質(zhì)和量的變化,主要體現(xiàn)在膠原蛋白降解及再次沉積,再次沉積的膠原纖維交聯(lián)增多、硬度增加。此外,重構(gòu)的膠原纖維排列形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化,由包繞癌灶卷曲形態(tài)變?yōu)榇┻^(guò)癌灶的線(xiàn)性形態(tài),腫瘤細(xì)胞可在此重構(gòu)的線(xiàn)性膠原纖維上快速移動(dòng),導(dǎo)致侵襲性大大增強(qiáng),有研究者將此穿過(guò)癌巢的膠原纖維稱(chēng)為腫瘤侵襲“高速公路”。Provenzano等將這種重構(gòu)的膠原纖維定義為腫瘤相關(guān)膠原纖維形態(tài)(Tumor-associated collagen signature, TACS), TACS共分為3個(gè)階段,TACS-3階段的膠原纖維即為ECM重構(gòu)后的膠原纖維形態(tài),Conklin等也報(bào)道了TACS-3形態(tài)的出現(xiàn)可作為乳腺癌患者的獨(dú)立不良預(yù)后指標(biāo)。此外,腫瘤ECM內(nèi)的膠原纖維還可分泌趨化因子募集炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),通過(guò)分泌多種與腫瘤增殖相關(guān)細(xì)胞因子,例如白介素-1β (IL-1β)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)及E選擇素,促進(jìn)腫瘤血管生成、細(xì)胞粘附、誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象等多個(gè)方面提升腫瘤侵襲性。綜上所述,腫瘤ECM中的發(fā)生重構(gòu)的膠原纖維從多個(gè)方面促進(jìn)了腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移。 Plod2是一種功能性的酶,位于細(xì)胞質(zhì)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng),參與膠原蛋白的翻譯后修飾,主要功能是催化膠原蛋白端肽區(qū)賴(lài)氨酸殘基羥基化。發(fā)生賴(lài)氨酸羥基化的膠原蛋白在分泌出細(xì)胞外后可相互交聯(lián)形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的羥賴(lài)氨酸吡啶鏈,相反,未發(fā)生羥基化的膠原蛋白所形成的纖維交聯(lián)不穩(wěn)定,容易降解。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Plod2表達(dá)明顯升高時(shí),由于羥賴(lài)氨酸吡啶鏈生成增加,將導(dǎo)致膠原纖維過(guò)度沉積,多項(xiàng)研究報(bào)道了纖維化疾病與Plod2過(guò)表達(dá)相關(guān)。前文已述,膠原纖維的重構(gòu)在促進(jìn)腫瘤侵襲性起了非常重要的作用,由此我們推測(cè)Plod2可能參與了腫瘤中的ECM重構(gòu)過(guò)程,促進(jìn)腫瘤ECM膠原纖維沉積,并通過(guò)形成癌巢內(nèi)TACS-3形態(tài)膠原纖維提升了腫瘤細(xì)胞的侵襲性。目前,國(guó)內(nèi)外大部分關(guān)于Plod2與惡性腫瘤方面的研究?jī)H僅涉及到基因芯片檢測(cè)水平,真正對(duì)Plod2與腫瘤機(jī)制方面的探討極少。Gilkes等在Plod2與在乳腺癌的研究中,發(fā)現(xiàn)Plod2高表達(dá)與腫瘤患者高死亡率相關(guān),對(duì)于癌組織的膠原纖維形成必不可少,為驗(yàn)證Plod2促進(jìn)腫瘤侵襲的功能,分別將乳腺癌細(xì)胞和沉默Plod2表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞注射入裸鼠體內(nèi)成瘤,沉默Plod2表達(dá)的移植瘤組織硬度低,膠原纖維沉積量明顯減少,且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶及肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量明顯減少,提示了Plod2與腫瘤侵襲性的密切聯(lián)系。Eisinger-Mathason等在未分化肉瘤的研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Plod2抑制劑米諾地爾能夠減少癌巢內(nèi)膠原纖維沉積,并減少了腫瘤肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。 關(guān)于Plod2與宮頸癌的報(bào)道較少,Rajkumar等運(yùn)用基因芯片技術(shù)分析了28例宮頸癌、4例CIN3/原位癌、4例CIN1/CIN2以及5例正常宮頸組織的基因表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)其中包括了Plod2在內(nèi)的基因在宮頸癌中高表達(dá)。然而,Plod2蛋白在宮頸癌組織中是否高表達(dá)?能否作為宮頸癌患者有效預(yù)測(cè)指標(biāo)?能否成為預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的新的治療靶位?這些疑問(wèn)尚有待研究。 HIF-1αa促進(jìn)宮頸癌侵襲性增加已經(jīng)得到共識(shí),但其現(xiàn)象下的機(jī)制并不清楚。多項(xiàng)研究證實(shí),HIF-1α可上調(diào)Plod2表達(dá)。因此我們猜想在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,HIF-1α可能通過(guò)誘導(dǎo)了Plod2表達(dá)升高,繼而改變膠原纖維交聯(lián)模式并最終通過(guò)ECM重構(gòu)促進(jìn)宮頸癌侵襲性改變。我們所進(jìn)行的研究,均圍繞上述猜想而展開(kāi)。 研究方法 1、檢測(cè)PIod2在宮頸癌及癌旁組織的表達(dá)情況 本研究需新鮮組織標(biāo)本均來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科,共11例宮頸癌、對(duì)應(yīng)的癌旁組織手術(shù)標(biāo)本。RT-PCR檢測(cè)11例宮頸癌與癌旁組織Plod2表達(dá)差異。 2、免疫組化檢測(cè)宮頸癌癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中Plod2、HIF-1α的表達(dá) 收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院2005年1月至2012年1月共164例宮頸癌標(biāo)本及13例宮頸慢性不典型增生石蠟標(biāo)本,其中164例標(biāo)本中有75例對(duì)應(yīng)的癌旁組織。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)組織中Plod2、HIF-1α蛋白表達(dá),根據(jù)染色的范圍及染色強(qiáng)度評(píng)分,分析Plod2、HIF-1α表達(dá)情況與宮頸癌患者臨床病理學(xué)特征之間的聯(lián)系,運(yùn)用Spearman統(tǒng)計(jì)方法法分析HIF-1α與Plod2之間的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素分析,Hazard ration (HR)采用Cox模型計(jì)算得出。 3、檢測(cè)宮頸癌組織中膠原蛋白含量,分析Plod2表達(dá)與膠原蛋白沉積的關(guān)系 1)從上述Plod2高表達(dá)的新鮮宮頸癌標(biāo)本中選取6對(duì)癌與癌旁組織,Western blot檢測(cè)宮頸癌與癌旁組織一型膠原蛋白(Co1-Ⅰ)的表達(dá)差異。 2)將164例患者根據(jù)Plod2表達(dá)水平高低分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,并將病理切片進(jìn)行天狼星紅染色,觀(guān)察Plod2不同表達(dá)水平癌巢內(nèi)膠原纖維形態(tài),運(yùn)用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件分析膠原纖維在沉積在整個(gè)視野內(nèi)所占百分比。分別計(jì)算兩組平均膠原纖維沉積百分比,通過(guò)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組平均值。 4、檢測(cè)米諾地爾對(duì)Siha細(xì)胞Plod2表達(dá)的抑制作用 Plod2在宮頸癌細(xì)胞株的表達(dá)情況。 標(biāo)本來(lái)源：宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤科實(shí)驗(yàn)室保存,用加入了10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)。2例正常宮頸組織來(lái)自南方醫(yī)院婦產(chǎn)科。 Western blot檢測(cè)Plod2在宮頸癌細(xì)胞株的表達(dá),2例正常宮頸組織作為對(duì)照。 2)培養(yǎng)宮頸癌Siha細(xì)胞株,用不同濃度米諾地爾作用Siha細(xì)胞后,光鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài),Western blot檢測(cè)Plod2的表達(dá)；同一濃度作用Siha細(xì)胞,不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞,Western blot檢測(cè)Plod2的表達(dá)；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)米諾地爾作用后細(xì)胞遷移能力的變化。 研究結(jié)果 1. Plod2在新鮮宮頸癌標(biāo)本中的表達(dá)情況 用RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)11對(duì)宮頸癌及癌旁組織,發(fā)現(xiàn)9例癌組織的Plod2轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織,比值均為2倍以上。 2.免疫組化檢測(cè)Plod2、HIF-1α在宮頸癌組織中的表達(dá) (1) Plod2在164例宮頸癌標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率為60.4%,其中75例同時(shí)具有癌與癌旁組織的標(biāo)本中Plod2陽(yáng)性表達(dá)率分別為42.7%,0%；13例宮頸上皮瘤樣變僅一例弱陽(yáng)性。 (2)Plod2的高表達(dá)與宮頸癌的脈管癌栓(P=0.007)、深肌層浸潤(rùn)(P=0.001)、腫瘤大小(P=0.018)、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.025)密切相關(guān),與其年齡、分期、病理分類(lèi)、病理分級(jí)無(wú)關(guān)。 (3)HIF-la的高表達(dá)與宮頸癌的腫瘤大小(P=0.024)、深肌層浸潤(rùn)(P=0.016)密切相關(guān),與患者年齡、分期、病理分類(lèi)、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。 (4) Spearman相關(guān)性分析提示,Plod2與HIF-la成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.400,P0.001。 (5)Cox生存分析提示Plod2為宮頸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素(P=0.004)。 3. Plod2表達(dá)與宮頸癌組織膠原蛋白含量之間的關(guān)系 1) Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)6對(duì)癌與癌旁組織中,一型膠原(COL-1)在癌組織的表達(dá)高于對(duì)應(yīng)的癌旁組織。 2)對(duì)164例宮頸癌切片進(jìn)行天狼星紅染色,發(fā)現(xiàn)Plod2高表達(dá)組的癌巢內(nèi)的癌細(xì)胞沿膠原纖維走形分布,結(jié)構(gòu)松散,膠原纖維形態(tài)致密,垂直穿過(guò)癌巢；Plod2低表達(dá)的癌巢內(nèi)癌細(xì)胞排列緊密,膠原沉積較少,主要呈現(xiàn)包繞癌巢周?chē)男螒B(tài)。 3)利用IPP圖像分析軟件得出Plod2高表達(dá)組平均膠原纖維沉積百分比為10.93±6.83(%),Plod2低表達(dá)組平均膠原纖維沉積百分比為5.59±4.89(%),兩組膠原纖維沉積百分比的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 4.米諾地爾對(duì)Siha細(xì)胞Plod2的抑制作用 1)宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa中Plod2在蛋白水平表達(dá)明顯高于正常宮頸上皮組織。 2) Siha細(xì)胞株經(jīng)米諾地爾濃度梯度以及時(shí)間梯度作用后,Plod2表達(dá)均有下降,細(xì)胞形態(tài)由梭型變?yōu)闄E圓且偽足減少；此外,經(jīng)米諾地爾作用,Siha細(xì)胞遷移能力明顯下降。 結(jié)論 1) Plod2在宮頸癌細(xì)胞及組織中高表達(dá),其高表達(dá)與宮頸癌的侵襲性升高密切相關(guān),是宮頸癌患者獨(dú)立不良預(yù)后因子； 2)宮頸癌侵襲性的升高可能通過(guò)HIF-1α、Plod2途徑,促進(jìn)腫瘤ECM膠原纖維重構(gòu)實(shí)現(xiàn)； 3) Plod2有可能成為判斷宮頸癌患者進(jìn)展及預(yù)后分子標(biāo)志物,為宮頸癌的預(yù)后判斷及治療提供了新的分子靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2325394