【摘要】：研究背景： 血管生成（angiogenesis）在維持卵巢生理功能和卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，提示抗腫瘤血管生成在抗腫瘤治療中具有重要的地位。目前抗VEGF及其受體的藥物在卵巢癌已進(jìn)入臨床應(yīng)用，取得了初期的療效，但對高級別的腫瘤單純使用抗VEGF藥物難以控制腫瘤的進(jìn)展，容易引起耐藥，甚至引發(fā)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。由于腫瘤的血管生成過程是一個(gè)有多種因素參與的，多條信號通路調(diào)控的，極其復(fù)雜的過程，單獨(dú)使用某種血管生成抑制因子或是阻斷與血管生成相關(guān)的某一條信號通路并不能完全阻斷血管的生成，因而有必要尋找其他種類的靶基因。G蛋白偶聯(lián)受體（Gprotein-coupled receptors，GPCRs)介導(dǎo)的信號通路是細(xì)胞信號傳遞途徑中最常見的一種信號傳遞方式，對機(jī)體內(nèi)各個(gè)系統(tǒng)都有著重要的影響。近來研究發(fā)現(xiàn)GPCRs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此對GPCRs通路的調(diào)控在腫瘤的病理生理過程具有重要意義。G蛋白信號通路調(diào)節(jié)蛋白（Regulator of G Protein Signaling，RGS）是一類負(fù)性調(diào)節(jié)G蛋白信號傳導(dǎo)通路的蛋白分子，含有30多種蛋白質(zhì)。其中RGS5是G蛋白信號通路調(diào)節(jié)蛋白家族中的一員，通過促進(jìn)G蛋白α亞基的GTP酶活性，負(fù)性調(diào)控GPCRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。RGS5高表達(dá)于腫瘤新生血管發(fā)育成熟的初期,調(diào)節(jié)血管周細(xì)胞的分化與募集，參與血管成熟的調(diào)控。RGS5在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞（Tumor-derived microvascularendothelial cells, TdMECs）的表達(dá)明顯高于正常血管內(nèi)皮細(xì)胞，其基因表達(dá)上調(diào)會明顯降低新生血管對于抗VEGF所致的血管退行性變的敏感性，表明RGS5可能是重要的替代貝伐珠單抗耐藥性的抗血管生成靶點(diǎn)。 研究目的： 抗腫瘤血管生成治療的耐藥性源于腫瘤血管的異質(zhì)性，包括染色體的不穩(wěn)定性，容易產(chǎn)生耐藥株，而了解TdMECs的異質(zhì)性，尋找特異而有效的靶點(diǎn)，并通過組織來源不同的TdMECs作為藥物靶點(diǎn)的研究，可提高腫瘤抗血管生成藥物療效并降低耐藥性發(fā)生率。RGS5可負(fù)性調(diào)節(jié)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的GPCRs信號通路，作為一個(gè)最近一兩年漸漸受到關(guān)注的蛋白，RGS5的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚，它不僅參與血管周細(xì)胞的成熟，在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞亦有高表達(dá)。目前RGS5在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用尚未見報(bào)道，了解RGS5在卵巢癌的表達(dá)特點(diǎn)，研究其在卵巢癌血管生成中的作用及機(jī)制，將有利于多靶點(diǎn)抗血管生成的治療策略在卵巢癌的實(shí)施和發(fā)展。 研究方法： 1.回顧性分析87例卵巢癌組織標(biāo)本，通過連續(xù)切片檢測RGS5在卵巢上皮性腫瘤組織中的表達(dá)情況，分析RGS5與臨床各病理參數(shù)、患者生存時(shí)間以及微血管密度的關(guān)系。 2.在免疫磁珠細(xì)胞分選技術(shù)獲得高純度卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，通過對體外培養(yǎng)的卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（ovarian carcinoma-derived microvascular endothelialcells, ODMECs）形態(tài)、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)、體外成管以及生長增值能力的觀察，了解ODMECs是否在體外培養(yǎng)中的生物學(xué)特性，并檢測RGS5的表達(dá)情況和特點(diǎn)。 3.通過構(gòu)建RGS5特異性siRNA慢病毒載體下調(diào)RGS5蛋白的表達(dá)，了解RGS5參與調(diào)控的ODMECs體外生物學(xué)效應(yīng)，并進(jìn)一步探討RGS5在卵巢癌血管生成中的作用及機(jī)制。 主要結(jié)果： 1. RGS5不僅在腫瘤血管周細(xì)胞表達(dá)，在卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)與Endoglin標(biāo)記的血管相重疊，但鮮見于CD34標(biāo)記的成熟血管，在一些無CD34也無Endoglin表達(dá)的管腔樣結(jié)構(gòu)中亦偶見RGS5的陽性著色。Endoglin是新生血管的標(biāo)記物，主要表達(dá)于卵巢癌邊緣的微血管，其表達(dá)水平與上皮性卵巢癌（Epithelial ovariancancer, ECO）血管生成密切相關(guān)，提示RGS5可能參與了卵巢癌早期血管生成的調(diào)控。 2.第一次闡述了RGS5蛋白在卵巢癌細(xì)胞有表達(dá)，其表達(dá)的高低與卵巢癌患者腹膜轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，高表達(dá)RGS5的患者腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯低于低表達(dá)RGS5的患者，預(yù)后亦優(yōu)于后者。此外，RGS5在卵巢癌細(xì)胞的表達(dá)還與CD34標(biāo)記的微血管密度（microvascular densities, MVD）呈負(fù)相關(guān)。 3.與正常內(nèi)皮細(xì)胞多處于靜止期不同，ODMECs增生活躍，胞核遺傳物質(zhì)豐富，，高表達(dá)促血管生成因子VEGF、TGF-β的受體VEGFR2和Endoglin，體外成管能力增強(qiáng)。RGS5的表達(dá)在ODMECs體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成時(shí)降低，并且隨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長遞減，推測可能與離開腫瘤微環(huán)境有關(guān)，然而與RGS5作用密切相關(guān)的VEGF與PDGF-BB對其在體外的表達(dá)無明顯的刺激作用，說明RGS5在腫瘤組織的表達(dá)可能不依賴于或不僅僅依賴于VEGFR和PDGF-β信號通路的調(diào)節(jié)。 4.缺氧可誘導(dǎo)RGS5在ODMECs表達(dá)，通過慢病毒載體攜帶的RGS5特異性siRNA，實(shí)現(xiàn)對原代培養(yǎng)的ODMECs表達(dá)RGS5蛋白的高效抑制后發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下RGS5可抑制ODMECs細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期停滯于G1期到S期的轉(zhuǎn)化節(jié)點(diǎn)。此外RGS5在ODMECs缺氧時(shí)還可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，但不影響細(xì)胞的遷移能力。 5.干擾RGS5蛋白的表達(dá)可使分裂周期蛋白CDC25A以及與細(xì)胞周期密切相關(guān)的CDK2蛋白和細(xì)胞周期蛋白CyclinE表達(dá)增高；MAPK通路中ERK磷酸化明顯降低。ERK1/2抑制劑PD98059可影響CDC25A、CDK2及CyclinE蛋白的表達(dá)，其負(fù)性調(diào)節(jié)上述蛋白的表達(dá)與RGS5有協(xié)同效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用PD98059與LV-siRGS5同時(shí)處理ODMECs可明顯降低細(xì)胞的增殖率，提示RGS5可負(fù)性調(diào)節(jié)MAPK/ERK通路介導(dǎo)的CDC25A及下游蛋白CDK2和CyclinE的表達(dá)，參與ODMECs細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的調(diào)控。 結(jié)論： 本研究發(fā)現(xiàn)RGS5不僅在卵巢癌血管周細(xì)胞、在內(nèi)皮細(xì)胞亦有表達(dá)，在癌細(xì)胞的表達(dá)則與腹膜轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后相關(guān)，并且與微血管密度呈負(fù)相關(guān)。缺氧可誘導(dǎo)RGS5在ODMECs的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖。因此無論從內(nèi)皮細(xì)胞與血管周細(xì)胞的相互作用還是從抗血管生成與抗腫瘤轉(zhuǎn)移在腫瘤中的價(jià)值來看，RGS5在卵巢癌中的作用與機(jī)制都有不可忽視的研究前景。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐燕;王丹;謝堯;梁志清;;人卵巢癌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)及體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成的觀察[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2010年03期

2 ;Relationship between RGS5 expression and differentiation and angiogenesis of gastric carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2010年44期

本文編號：2325004