【摘要】：目的： 探討microRNA-145對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移功能的影響及可能的作用機(jī)制，為臨床卵巢癌的治療提供新的有效靶點(diǎn)。 方法： 采用qRT-PCR方法，驗(yàn)證包括miR-145在內(nèi)的7種microRNA在卵巢癌組織及卵巢良性腫瘤組織中的表達(dá)情況；針對(duì)miR-145做進(jìn)一步研究，利用miR-145mimic轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞，通過(guò)transwell侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)等方法研究miR-145對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞侵襲遷移等細(xì)胞功能的影響；構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告載體驗(yàn)證miR-145與靶基因MUC1的互補(bǔ)作用機(jī)制，包裝病毒載體，使SKOV3細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)miR-145，最后利用western blot、PCR等方法，探討miR-145對(duì)MUC1以及EMT關(guān)鍵蛋白E-cad的作用從而影響卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用機(jī)制。 結(jié)果： PCR結(jié)果顯示，與良性卵巢瘤組織相比，miR-200a，miR-93，miR-18，miR-146a在卵巢癌組織中的表達(dá)明顯增高，miR-143，miR-145，miR-29在卵巢癌組織中表達(dá)明顯下降；根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，miR-145序列與MUC13’UTR端序列互補(bǔ)，是其預(yù)測(cè)靶基因；western blot檢測(cè)顯示，MUC1蛋白在卵巢癌組織中表達(dá)明顯增高；將miR-145-5p mimic轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞48h后，，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)表明，穿過(guò)matrige膜的細(xì)胞數(shù)與NC組、MOCK組和Blank組相比較，顯著減少。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)表明，miR-145mimic組遷移出Transwell小室并種植到6孔板的細(xì)胞數(shù)明顯少于NC組、MOCK組和Blank組；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示劃痕后12h、24h、48h，miR-145-5p mimic（0.074、0.148、0.220）組細(xì)胞的遷移率明顯低于NC陰性對(duì)照組（0.087、0.242、0.276）、mock組（0.125、0.269、0.301）及Blank組（0.152、0.260、0.339），且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；DAPI染色測(cè)定SKOV3細(xì)胞凋亡后，miR-145-5p mimics組細(xì)胞的凋亡率與Blank組、mock組及NC陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）；以MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，細(xì)胞接種96孔板24h、48h和72h后，轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimics組與NC陰性對(duì)照組、Mock組、及Blank組比較，OD490值明顯下降，增殖活性明顯下降；以紫杉醇處理SKOV3細(xì)胞，用藥72h后，轉(zhuǎn)染miR-145-5p mimic組與NC陰性對(duì)照組、Mock組及Blank組比較OD490值明顯下降，同時(shí)，MUC1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，將含MUC13’UTR結(jié)合序列的熒光素酶報(bào)告載體和miR-145-5p mimic共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，檢測(cè)熒光表達(dá)顯著下降；將突變型載體與miR-145-5p mimic共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，熒光表達(dá)無(wú)顯著差異。成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-145的卵巢癌細(xì)胞系miR-145-CMV-RFP-SKOV3，檢測(cè)MUC1的蛋白表達(dá)量明顯減少，而E-cad的表達(dá)量增加；與之相反，卵巢癌細(xì)胞系miR-145-CMV-RFP-SKOV3轉(zhuǎn)染MUC1表達(dá)質(zhì)粒后，E-cad的表達(dá)量減少，SKOV3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)； 結(jié)論： miR-145是卵巢癌的抑癌基因，miR-145的上調(diào)能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移以及增殖，并能夠增強(qiáng)由紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制效應(yīng)。MUC1是miR-145的直接靶基因，后者通過(guò)與其互補(bǔ)結(jié)合抑制其蛋白表達(dá)，引起EMT標(biāo)志性蛋白E-cad表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明miR-145通過(guò)抑制MUC1/E-cad信號(hào)通路阻滯了EMT過(guò)程導(dǎo)致的SKOV3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移；而miR-145的這一作用能夠被MUC1上調(diào)解除，說(shuō)明MUC1是miR-145作用于EMT的橋梁因子。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2323363