【摘要】：卵巢癌病死率高、預(yù)后差。卵巢癌轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的關(guān)鍵,目前卵巢癌轉(zhuǎn)移的機制尚未明了。在眾多研究中,越來越多的流行病學(xué)資料和實驗肯定了雌激素(estrogen, E2)在卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移中的作用,認(rèn)為,E2促進卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移的作用主要通過E2誘導(dǎo)的靶基因?qū)崿F(xiàn)。已有的研究及本課題組前期工作已經(jīng)識別了一系列E2誘導(dǎo)的蛋白編碼基因并獲得了豐富研究成果,然而卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中E2誘導(dǎo)的靶基因絕不僅僅局限于蛋白編碼基因。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是最近備受矚目的哺乳動物轉(zhuǎn)錄組重要成員,相關(guān)研究雖剛剛起步,但已有的研究已表明IncRNA失調(diào)是多種癌癥的特征之一。IncRNA的發(fā)現(xiàn)為研究惡性腫瘤的生物學(xué)行為提供了重要契機。然而,在卵巢癌研究領(lǐng)域,IncRNA的報道不多,卵巢癌轉(zhuǎn)移過程中E2誘導(dǎo)的IncRNA的功能分析及機制探索更是個空白。有鑒于此,本課題中,我們借助ERa陽性(ERa+)卵巢癌細(xì)胞,明確E2是否能誘導(dǎo)IncRNA表達譜的變化,并圍繞某個E2誘導(dǎo)的IncRNA作深入研究,分析其表達變化與ERa陽性卵巢癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,通過體內(nèi)外實驗探討其表達變化是否能影響ERa陽性卵巢癌惡性生物學(xué)行為并探索其中的分子機制,本課題一方面將從IncRNA視角對雌激素與卵巢癌轉(zhuǎn)移研究網(wǎng)絡(luò)作一個重要補充,另一方面將為ERa+卵巢癌轉(zhuǎn)移機制及治療提供新思路和靶向,也為ERa+卵巢癌的預(yù)后提供新的潛在標(biāo)志物。第一部分雌激素誘導(dǎo)ERa陽性卵巢癌細(xì)胞中長鏈非編碼RNA-EIncRNA1的篩查驗證目的在ERa+卵巢癌細(xì)胞中,篩選E2誘導(dǎo)的IncRNAs;初步探討興趣IncRNA受E2調(diào)控的機制。方法 (1)利用IncRNA芯片比較E2刺激組與E2未刺激組ERa+卵巢癌細(xì)胞中IncRNA表達譜的變化；(2)通過生物信息學(xué)ERE位點預(yù)測,分析其中可能受經(jīng)典ERa-ERE途徑調(diào)控的IncRNAs;(3)從中挑選出興趣IncRNA,通過一系列實驗(ERa抑制劑、ERa干擾、ChIP實驗及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?證實E2誘導(dǎo)興趣lncRNA的表達是經(jīng)典ERa-ERE途徑依賴的。結(jié)果 (1)高通量IncRNA芯片比較發(fā)現(xiàn)：在ERa+卵巢癌細(xì)胞SKOV3中,E2刺激組與E2未刺激組相比有115個差異表達的IncRNAs(fold change≥1.5,P0.05)。(2)生物信息學(xué)ERE位點預(yù)測結(jié)果顯示：19個IncRNAs的啟動子區(qū)域含有ERE保守序列,預(yù)測E2誘導(dǎo)這19個IncRNAs的表達可能是經(jīng)典ERa-ERE途徑依賴的。其中,lncRNA-TC0101441受E2誘導(dǎo)上調(diào)的倍數(shù)最為顯著,被視為興趣分子,命名為Estrogen-induced long non-coding RNA-1 (ElncRNA1)。 (3)應(yīng)用ERa抑制劑ICI 182,780及ERa干擾小RNA (ERa-siRNA)均能顯著抑制E2誘導(dǎo)ElncRNA1的表達,證實E2上調(diào)ElncRNA1的表達是ERa依賴的;ChIP實驗結(jié)果顯示：ERa能特異性結(jié)合到ElncRNA1啟動子區(qū)域,E2刺激使兩者的結(jié)合增強；將野生型及突變型ERE質(zhì)粒與ERa過表達質(zhì)粒及空載體共轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示：過表達ERa后,ElncRNA1啟動子野生型ERE的活性明顯升高,在E2存在的情況下升高更明顯。另外,在有無雌激素時,ERE突變均降低了ERa誘導(dǎo)的ElncRNA1啟動子活性,證實E2上調(diào)ElncRNA1的表達是經(jīng)典ERa-ERE途徑依賴的。結(jié)論我們首次發(fā)現(xiàn)在ERα+卵巢癌細(xì)胞SKOV3中,E2能誘導(dǎo)IncRNAs表達譜的改變。同時,我們原創(chuàng)性地鑒定了一個E2誘導(dǎo)的新IncRNA-ElncRNA1,證實E2上調(diào)ElncRNA1的表達是經(jīng)典ERa-ERE途徑依賴的。第二部分ElncRNA1在ERa陽性卵巢癌組織中的表達及臨床意義目的 研究ElncRNA1在ERa+卵巢癌組織中的表達水平,分析ElncRNA1異常表達與ERa+卵巢癌臨床病理因素及預(yù)后之間的關(guān)系。方法 (1)收集上皮性卵巢癌組織96例,免疫組化檢測卵巢癌組織中ERa的表達情況。(2)實時定量PCR (quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測ERa+、ERa陰性(ERa-)及20例正常卵巢上皮組織中ElncRNA1的表達水平。(3)應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法分析ElncRNA1異常表達與ERa+卵巢癌臨床病理因素、總生存期(Overall Survival, OS)及無進展生存期(Progression-free Survival, PFS)的關(guān)系。結(jié)果 (1)免疫組化結(jié)果顯示：96例卵巢癌組織中,ERa+卵巢癌組織74例,ERa-卵巢癌組織22例。(2)qRT-PCR結(jié)果顯示：ElncRNA1在ERa+卵巢癌組織中的表達明顯高于ERa-卵巢癌組織及正常卵巢上皮組織。(3)臨床病理因素分析顯示：ElncRNA1的高表達與FIGO分期(Ⅲ-Ⅳ期)、組織學(xué)分級(G3)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P0.01),與年齡、病理類型、術(shù)后殘余留直徑、CA125、腹水無相關(guān)性。(4)生存分析顯示：ElncRNA1的高表達與OS和PFS顯著相關(guān)(P0.01)；進一步的多因素Cox風(fēng)險模型分析證實了EncRNA1的高表達在OS和PFS上是ERα+卵巢癌的獨立預(yù)后因素(P0.05)。結(jié)論ElncRNAl的高表達與ERα+卵巢癌的惡性生物學(xué)特征,包括FIGO分期(Ⅲ-Ⅳ期)、組織學(xué)分級(G3)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；ElncRNA1是ERα+卵巢癌患者的獨立預(yù)后指標(biāo)。第三部分ElncRNA1在ERα陽性卵巢癌細(xì)胞惡性表型中作用的體外實驗研究目的探討ElncRNA1表達變化對ERα+卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移及侵襲表型的影響。方法 (1)qRT-PCR檢測6株ERα+卵巢癌細(xì)胞(SKOV3、CAOV3、OVCAR3、 HO8910、PEO1及PEO4)中ElncRNA1的表達水平；從中選擇細(xì)胞株,采用慢病毒技術(shù)構(gòu)建2株ElncRNA1干擾株及1株過表達株。(2)采用CCK-8實驗評估干擾/過表達ElncRNA1對ERα+卵巢癌細(xì)胞增殖表型的影響。(3)利用流式細(xì)胞儀分析干擾/過表達ElncRNA1對ERα+卵巢癌細(xì)胞凋亡表型及細(xì)胞周期的影響。(4)使用細(xì)胞劃痕法及Transwell侵襲實驗評估干擾/過表達ElncRNA1對ERα+卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲表型的影響。結(jié)果 (1)qRT-PCR結(jié)果顯示：在6株ERα+卵巢癌細(xì)胞中,SKOV3及CAOV3細(xì)胞中ElncRNA1的表達較高,構(gòu)建了ElncRNA1慢病毒干擾株；HO8910細(xì)胞中ElncRNA1的表達最低,構(gòu)建了ElncRNA1慢病毒過表達株。(2)CCK-8增殖實驗結(jié)果顯示：與對照組相比,干擾ElncRNA1的SKOV3和CAOV3細(xì)胞增殖能力降低,過表達ElncRNA1的HO8910細(xì)胞增殖能力增強,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(3)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期的結(jié)果顯示：干擾ElncRNA1的SKOV3和CAOV3細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均升高,但細(xì)胞周期未見明顯改變；過表達ElncRNA1的HO8910細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均未見明顯改變,但進入S期細(xì)胞的比例升高,阻滯在G0～G1期細(xì)胞的比例相對下降,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。(4)細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示：48h后,干擾ElncRNA1的SKOV3和CAOV3細(xì)胞的遷移能力明顯弱于對照組；24h后,過表達ElncRNA1的HO8910細(xì)胞的遷移能力明顯強于對照組。Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示：干擾ElncRNA1的SKOV3和CAOV3細(xì)胞穿過小室基底膜的細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯降低。而過表達ElncRNA1的H08910細(xì)胞穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯增加。結(jié)論在細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移及侵襲惡性表型中,干擾和過表達ElncRNA1對ERa陽性卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響最為顯著,提示ElncRNA1在ERa陽性卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲中扮演著重要角色。第四部分干擾ElncRNA1對ERa陽性卵巢癌腹腔種植瘤播散轉(zhuǎn)移影響的體內(nèi)實驗研究目的構(gòu)建裸鼠卵巢癌腹腔種植瘤模型,探討干擾ElncRNA1在體內(nèi)對腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。方法體外培養(yǎng)干擾ElncRNA1、并攜帶綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的慢病毒SKOV3細(xì)胞及對照SKOV3細(xì)胞,利用最佳篩選濃度嘌呤霉素溶液進行篩選,獲得干擾ElncRNA1的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(LV-ElncRNA1-shRNA-SKOV3)及對照穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(LV-NC-SKOV3)。腹腔注射LV-ElncRNA 1-shRNA-SKOV3細(xì)胞及LV-NC-SKOV3細(xì)胞,構(gòu)建裸鼠卵巢癌腹腔種植瘤模型,分為實驗組及對照組。腹腔注射腫瘤細(xì)胞后,每周進行活體成像一次,動態(tài)監(jiān)測兩組裸鼠腹腔內(nèi)種植瘤播散的變化。腹腔注射腫瘤細(xì)胞4周后處死裸鼠,觀察兩組裸鼠腹腔種植瘤播散轉(zhuǎn)移情況,比較兩組種植瘤的數(shù)目及重量。結(jié)果腹腔注射腫瘤細(xì)胞4周后,活體成像結(jié)果顯示：對照組可見大面積的種植瘤腹腔播散轉(zhuǎn)移結(jié)點灶,而干擾ElncRNA1后,裸鼠種植瘤腹腔播散轉(zhuǎn)移結(jié)點灶顯著減少。處死所有裸鼠,打開腹腔發(fā)現(xiàn)：對照組裸鼠的種植瘤個數(shù)多,腹腔播散廣泛,腸曲間、肝臟均有種植瘤生長；然而,干擾ElncRNA1組裸鼠的種植瘤個數(shù)少、腹腔播散局限,腸曲間及肝臟僅少量或無種植瘤生長。將各組裸鼠腹腔種植瘤剝離后計數(shù),發(fā)現(xiàn)干擾ElncRNA1組種植瘤數(shù)目(9.33±1.86)較對照組(51.33±4.59)顯著減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；同時,將剝離后瘤體稱重,發(fā)現(xiàn)干擾ElncRNA1組種植瘤重量(0.15土0.01 g)較對照組(0.81±0.05 g)減少5.4倍,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論 干擾ElncRNA1顯著抑制裸鼠腹腔種植瘤的播散轉(zhuǎn)移,表明在體內(nèi),ElncRNA1能促進ERa陽性卵巢癌的轉(zhuǎn)移。第五部分ElncRNA1促進ERα陽性卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)機制的初步探索目的初步探索ElncRNA1促進ERα陽性卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機制。方法在干擾ElncRNA1的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)株及對照株中,利用腫瘤轉(zhuǎn)移基因PCR芯片篩選差異表達的腫瘤轉(zhuǎn)移基因；利用qRT-PCR在過表達ElncRNA1的H08910細(xì)胞株及對照株中進一步驗證差異基因的表達,以探尋ElncRNA1促ERα陽性卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的下游調(diào)控分子。從中找尋線索,利用western blot、免疫組化、siRNA干擾等實驗初步探索其中的分子機制。結(jié)果(1)轉(zhuǎn)移基因PCR芯片結(jié)果顯示：與對照相比,在干擾ElncRNA1的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)株中篩選出差異表達(fold change≥ 5)的基因共1 0個。(2)qRT-PCR進一步檢測過表達ElncRNAl的H08910細(xì)胞及對照株中上述10個腫瘤轉(zhuǎn)移基因mRNA的表達改變,結(jié)果顯示：過表達ElncRNA1引起5個轉(zhuǎn)移基因的表達改變與敲除ElncRNA1引起的表達改變相一致。其中,絕大多數(shù)基因為EMT相關(guān)基因,被視為ElncRNA1可能調(diào)控EMT的重要線索。(3)Western blot檢測EMT標(biāo)志性分子,結(jié)果顯示：與對照相比,干擾ElncRNA1的穩(wěn)轉(zhuǎn)SKOV3細(xì)胞高表達上皮性標(biāo)志分子E-cadherin,低表達間質(zhì)性標(biāo)志分子FN-1及N-cadherin;免疫組化檢測體內(nèi)裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤組織中E-cadherin、FN-1及N-cadherin的表達,結(jié)果顯示：干擾ElncRNA1組的E-cadherin表達較高,而FN-1及N-cadherin表達降低。 (4)qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist的表達改變,結(jié)果顯示：干擾／過表達ElncRNA1后,Snail的表達改變最為顯著；western blot及裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤組織的免疫組化結(jié)果進一步證實：干擾ElncRNA1顯著降低Snail的表達。(5)在過表達ElncRNA1的H08910細(xì)胞中應(yīng)用Snail-siRNA能顯著抑制ElncRNA1對E-cadherin、FN-1及N-cadherin的表達改變,說明ElncRNA1通過Snail影響了EMT標(biāo)志分子的表達,為ElncRNA1通過Snail影響EMT進程提供了依據(jù)。結(jié)論ElncRNA1通過Snail促進ERa陽性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT,進而賦予ERa陽性卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的惡性表型。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

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本文編號：2322034