【摘要】：卵巢癌病死率高、預(yù)后差。卵巢癌轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的關(guān)鍵,目前卵巢癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚未明了。在眾多研究中,越來(lái)越多的流行病學(xué)資料和實(shí)驗(yàn)肯定了雌激素(estrogen, E2)在卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移中的作用,認(rèn)為,E2促進(jìn)卵巢癌增殖、轉(zhuǎn)移的作用主要通過(guò)E2誘導(dǎo)的靶基因?qū)崿F(xiàn)。已有的研究及本課題組前期工作已經(jīng)識(shí)別了一系列E2誘導(dǎo)的蛋白編碼基因并獲得了豐富研究成果,然而卵巢癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中E2誘導(dǎo)的靶基因絕不僅僅局限于蛋白編碼基因。長(zhǎng)鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, IncRNA)是最近備受矚目的哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄組重要成員,相關(guān)研究雖剛剛起步,但已有的研究已表明IncRNA失調(diào)是多種癌癥的特征之一。IncRNA的發(fā)現(xiàn)為研究惡性腫瘤的生物學(xué)行為提供了重要契機(jī)。然而,在卵巢癌研究領(lǐng)域,IncRNA的報(bào)道不多,卵巢癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中E2誘導(dǎo)的IncRNA的功能分析及機(jī)制探索更是個(gè)空白。有鑒于此,本課題中,我們借助ERa陽(yáng)性(ERa+)卵巢癌細(xì)胞,明確E2是否能誘導(dǎo)IncRNA表達(dá)譜的變化,并圍繞某個(gè)E2誘導(dǎo)的IncRNA作深入研究,分析其表達(dá)變化與ERa陽(yáng)性卵巢癌臨床病理因素及預(yù)后的關(guān)系。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討其表達(dá)變化是否能影響ERa陽(yáng)性卵巢癌惡性生物學(xué)行為并探索其中的分子機(jī)制,本課題一方面將從IncRNA視角對(duì)雌激素與卵巢癌轉(zhuǎn)移研究網(wǎng)絡(luò)作一個(gè)重要補(bǔ)充,另一方面將為ERa+卵巢癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及治療提供新思路和靶向,也為ERa+卵巢癌的預(yù)后提供新的潛在標(biāo)志物。第一部分雌激素誘導(dǎo)ERa陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA-EIncRNA1的篩查驗(yàn)證目的在ERa+卵巢癌細(xì)胞中,篩選E2誘導(dǎo)的IncRNAs;初步探討興趣IncRNA受E2調(diào)控的機(jī)制。方法 (1)利用IncRNA芯片比較E2刺激組與E2未刺激組ERa+卵巢癌細(xì)胞中IncRNA表達(dá)譜的變化；(2)通過(guò)生物信息學(xué)ERE位點(diǎn)預(yù)測(cè),分析其中可能受經(jīng)典ERa-ERE途徑調(diào)控的IncRNAs;(3)從中挑選出興趣IncRNA,通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)(ERa抑制劑、ERa干擾、ChIP實(shí)驗(yàn)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn))證實(shí)E2誘導(dǎo)興趣lncRNA的表達(dá)是經(jīng)典ERa-ERE途徑依賴的。結(jié)果 (1)高通量IncRNA芯片比較發(fā)現(xiàn)：在ERa+卵巢癌細(xì)胞SKOV3中,E2刺激組與E2未刺激組相比有115個(gè)差異表達(dá)的IncRNAs(fold change≥1.5,P0.05)。(2)生物信息學(xué)ERE位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：19個(gè)IncRNAs的啟動(dòng)子區(qū)域含有ERE保守序列,預(yù)測(cè)E2誘導(dǎo)這19個(gè)IncRNAs的表達(dá)可能是經(jīng)典ERa-ERE途徑依賴的。其中,lncRNA-TC0101441受E2誘導(dǎo)上調(diào)的倍數(shù)最為顯著,被視為興趣分子,命名為Estrogen-induced long non-coding RNA-1 (ElncRNA1)。 (3)應(yīng)用ERa抑制劑ICI 182,780及ERa干擾小RNA (ERa-siRNA)均能顯著抑制E2誘導(dǎo)ElncRNA1的表達(dá),證實(shí)E2上調(diào)ElncRNA1的表達(dá)是ERa依賴的;ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ERa能特異性結(jié)合到ElncRNA1啟動(dòng)子區(qū)域,E2刺激使兩者的結(jié)合增強(qiáng)；將野生型及突變型ERE質(zhì)粒與ERa過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及空載體共轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞,雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)ERa后,ElncRNA1啟動(dòng)子野生型ERE的活性明顯升高,在E2存在的情況下升高更明顯。另外,在有無(wú)雌激素時(shí),ERE突變均降低了ERa誘導(dǎo)的ElncRNA1啟動(dòng)子活性,證實(shí)E2上調(diào)ElncRNA1的表達(dá)是經(jīng)典ERa-ERE途徑依賴的。結(jié)論我們首次發(fā)現(xiàn)在ERα+卵巢癌細(xì)胞SKOV3中,E2能誘導(dǎo)IncRNAs表達(dá)譜的改變。同時(shí),我們?cè)瓌?chuàng)性地鑒定了一個(gè)E2誘導(dǎo)的新IncRNA-ElncRNA1,證實(shí)E2上調(diào)ElncRNA1的表達(dá)是經(jīng)典ERa-ERE途徑依賴的。第二部分ElncRNA1在ERa陽(yáng)性卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義目的 研究ElncRNA1在ERa+卵巢癌組織中的表達(dá)水平,分析ElncRNA1異常表達(dá)與ERa+卵巢癌臨床病理因素及預(yù)后之間的關(guān)系。方法 (1)收集上皮性卵巢癌組織96例,免疫組化檢測(cè)卵巢癌組織中ERa的表達(dá)情況。(2)實(shí)時(shí)定量PCR (quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測(cè)ERa+、ERa陰性(ERa-)及20例正常卵巢上皮組織中ElncRNA1的表達(dá)水平。(3)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析ElncRNA1異常表達(dá)與ERa+卵巢癌臨床病理因素、總生存期(Overall Survival, OS)及無(wú)進(jìn)展生存期(Progression-free Survival, PFS)的關(guān)系。結(jié)果 (1)免疫組化結(jié)果顯示：96例卵巢癌組織中,ERa+卵巢癌組織74例,ERa-卵巢癌組織22例。(2)qRT-PCR結(jié)果顯示：ElncRNA1在ERa+卵巢癌組織中的表達(dá)明顯高于ERa-卵巢癌組織及正常卵巢上皮組織。(3)臨床病理因素分析顯示：ElncRNA1的高表達(dá)與FIGO分期(Ⅲ-Ⅳ期)、組織學(xué)分級(jí)(G3)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P0.01),與年齡、病理類(lèi)型、術(shù)后殘余留直徑、CA125、腹水無(wú)相關(guān)性。(4)生存分析顯示：ElncRNA1的高表達(dá)與OS和PFS顯著相關(guān)(P0.01)；進(jìn)一步的多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析證實(shí)了EncRNA1的高表達(dá)在OS和PFS上是ERα+卵巢癌的獨(dú)立預(yù)后因素(P0.05)。結(jié)論ElncRNAl的高表達(dá)與ERα+卵巢癌的惡性生物學(xué)特征,包括FIGO分期(Ⅲ-Ⅳ期)、組織學(xué)分級(jí)(G3)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；ElncRNA1是ERα+卵巢癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。第三部分ElncRNA1在ERα陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞惡性表型中作用的體外實(shí)驗(yàn)研究目的探討ElncRNA1表達(dá)變化對(duì)ERα+卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移及侵襲表型的影響。方法 (1)qRT-PCR檢測(cè)6株ERα+卵巢癌細(xì)胞(SKOV3、CAOV3、OVCAR3、 HO8910、PEO1及PEO4)中ElncRNA1的表達(dá)水平；從中選擇細(xì)胞株,采用慢病毒技術(shù)構(gòu)建2株ElncRNA1干擾株及1株過(guò)表達(dá)株。(2)采用CCK-8實(shí)驗(yàn)評(píng)估干擾/過(guò)表達(dá)ElncRNA1對(duì)ERα+卵巢癌細(xì)胞增殖表型的影響。(3)利用流式細(xì)胞儀分析干擾/過(guò)表達(dá)ElncRNA1對(duì)ERα+卵巢癌細(xì)胞凋亡表型及細(xì)胞周期的影響。(4)使用細(xì)胞劃痕法及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)估干擾/過(guò)表達(dá)ElncRNA1對(duì)ERα+卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲表型的影響。結(jié)果 (1)qRT-PCR結(jié)果顯示：在6株ERα+卵巢癌細(xì)胞中,SKOV3及CAOV3細(xì)胞中ElncRNA1的表達(dá)較高,構(gòu)建了ElncRNA1慢病毒干擾株；HO8910細(xì)胞中ElncRNA1的表達(dá)最低,構(gòu)建了ElncRNA1慢病毒過(guò)表達(dá)株。(2)CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比,干擾ElncRNA1的SKOV3和CAOV3細(xì)胞增殖能力降低,過(guò)表達(dá)ElncRNA1的HO8910細(xì)胞增殖能力增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期的結(jié)果顯示：干擾ElncRNA1的SKOV3和CAOV3細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均升高,但細(xì)胞周期未見(jiàn)明顯改變；過(guò)表達(dá)ElncRNA1的HO8910細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均未見(jiàn)明顯改變,但進(jìn)入S期細(xì)胞的比例升高,阻滯在G0～G1期細(xì)胞的比例相對(duì)下降,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：48h后,干擾ElncRNA1的SKOV3和CAOV3細(xì)胞的遷移能力明顯弱于對(duì)照組；24h后,過(guò)表達(dá)ElncRNA1的HO8910細(xì)胞的遷移能力明顯強(qiáng)于對(duì)照組。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：干擾ElncRNA1的SKOV3和CAOV3細(xì)胞穿過(guò)小室基底膜的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯降低。而過(guò)表達(dá)ElncRNA1的H08910細(xì)胞穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯增加。結(jié)論在細(xì)胞增殖、凋亡、周期、遷移及侵襲惡性表型中,干擾和過(guò)表達(dá)ElncRNA1對(duì)ERa陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲能力的影響最為顯著,提示ElncRNA1在ERa陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲中扮演著重要角色。第四部分干擾ElncRNA1對(duì)ERa陽(yáng)性卵巢癌腹腔種植瘤播散轉(zhuǎn)移影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究目的構(gòu)建裸鼠卵巢癌腹腔種植瘤模型,探討干擾ElncRNA1在體內(nèi)對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。方法體外培養(yǎng)干擾ElncRNA1、并攜帶綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的慢病毒SKOV3細(xì)胞及對(duì)照SKOV3細(xì)胞,利用最佳篩選濃度嘌呤霉素溶液進(jìn)行篩選,獲得干擾ElncRNA1的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(LV-ElncRNA1-shRNA-SKOV3)及對(duì)照穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(LV-NC-SKOV3)。腹腔注射LV-ElncRNA 1-shRNA-SKOV3細(xì)胞及LV-NC-SKOV3細(xì)胞,構(gòu)建裸鼠卵巢癌腹腔種植瘤模型,分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。腹腔注射腫瘤細(xì)胞后,每周進(jìn)行活體成像一次,動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)兩組裸鼠腹腔內(nèi)種植瘤播散的變化。腹腔注射腫瘤細(xì)胞4周后處死裸鼠,觀察兩組裸鼠腹腔種植瘤播散轉(zhuǎn)移情況,比較兩組種植瘤的數(shù)目及重量。結(jié)果腹腔注射腫瘤細(xì)胞4周后,活體成像結(jié)果顯示：對(duì)照組可見(jiàn)大面積的種植瘤腹腔播散轉(zhuǎn)移結(jié)點(diǎn)灶,而干擾ElncRNA1后,裸鼠種植瘤腹腔播散轉(zhuǎn)移結(jié)點(diǎn)灶顯著減少。處死所有裸鼠,打開(kāi)腹腔發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組裸鼠的種植瘤個(gè)數(shù)多,腹腔播散廣泛,腸曲間、肝臟均有種植瘤生長(zhǎng)；然而,干擾ElncRNA1組裸鼠的種植瘤個(gè)數(shù)少、腹腔播散局限,腸曲間及肝臟僅少量或無(wú)種植瘤生長(zhǎng)。將各組裸鼠腹腔種植瘤剝離后計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)干擾ElncRNA1組種植瘤數(shù)目(9.33±1.86)較對(duì)照組(51.33±4.59)顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；同時(shí),將剝離后瘤體稱重,發(fā)現(xiàn)干擾ElncRNA1組種植瘤重量(0.15土0.01 g)較對(duì)照組(0.81±0.05 g)減少5.4倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論 干擾ElncRNA1顯著抑制裸鼠腹腔種植瘤的播散轉(zhuǎn)移,表明在體內(nèi),ElncRNA1能促進(jìn)ERa陽(yáng)性卵巢癌的轉(zhuǎn)移。第五部分ElncRNA1促進(jìn)ERα陽(yáng)性卵巢癌轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的初步探索目的初步探索ElncRNA1促進(jìn)ERα陽(yáng)性卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。方法在干擾ElncRNA1的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)株及對(duì)照株中,利用腫瘤轉(zhuǎn)移基因PCR芯片篩選差異表達(dá)的腫瘤轉(zhuǎn)移基因；利用qRT-PCR在過(guò)表達(dá)ElncRNA1的H08910細(xì)胞株及對(duì)照株中進(jìn)一步驗(yàn)證差異基因的表達(dá),以探尋ElncRNA1促ERα陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的下游調(diào)控分子。從中找尋線索,利用western blot、免疫組化、siRNA干擾等實(shí)驗(yàn)初步探索其中的分子機(jī)制。結(jié)果(1)轉(zhuǎn)移基因PCR芯片結(jié)果顯示：與對(duì)照相比,在干擾ElncRNA1的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)株中篩選出差異表達(dá)(fold change≥ 5)的基因共1 0個(gè)。(2)qRT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)過(guò)表達(dá)ElncRNAl的H08910細(xì)胞及對(duì)照株中上述10個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移基因mRNA的表達(dá)改變,結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)ElncRNA1引起5個(gè)轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)改變與敲除ElncRNA1引起的表達(dá)改變相一致。其中,絕大多數(shù)基因?yàn)镋MT相關(guān)基因,被視為ElncRNA1可能調(diào)控EMT的重要線索。(3)Western blot檢測(cè)EMT標(biāo)志性分子,結(jié)果顯示：與對(duì)照相比,干擾ElncRNA1的穩(wěn)轉(zhuǎn)SKOV3細(xì)胞高表達(dá)上皮性標(biāo)志分子E-cadherin,低表達(dá)間質(zhì)性標(biāo)志分子FN-1及N-cadherin;免疫組化檢測(cè)體內(nèi)裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤組織中E-cadherin、FN-1及N-cadherin的表達(dá),結(jié)果顯示：干擾ElncRNA1組的E-cadherin表達(dá)較高,而FN-1及N-cadherin表達(dá)降低。 (4)qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Slug、Twist的表達(dá)改變,結(jié)果顯示：干擾／過(guò)表達(dá)ElncRNA1后,Snail的表達(dá)改變最為顯著；western blot及裸鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤組織的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)：干擾ElncRNA1顯著降低Snail的表達(dá)。(5)在過(guò)表達(dá)ElncRNA1的H08910細(xì)胞中應(yīng)用Snail-siRNA能顯著抑制ElncRNA1對(duì)E-cadherin、FN-1及N-cadherin的表達(dá)改變,說(shuō)明ElncRNA1通過(guò)Snail影響了EMT標(biāo)志分子的表達(dá),為ElncRNA1通過(guò)Snail影響EMT進(jìn)程提供了依據(jù)。結(jié)論ElncRNA1通過(guò)Snail促進(jìn)ERa陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT,進(jìn)而賦予ERa陽(yáng)性卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的惡性表型。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 邱君君;長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ElncRNA1在ERα陽(yáng)性卵巢癌轉(zhuǎn)移中功能及機(jī)制的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：2322034