【摘要】：研究背景胎盤特異性抗原8 (placenta-specific 8, PLAC8),是近年來被發(fā)現(xiàn)的在小鼠胎盤富集的生物分子。PLAC8被報道參與斑馬魚的早期胚胎發(fā)育和小鼠的胎盤發(fā)育。國外多項研究結果表明,PLAC8可能是牛胚胎著床過程中的關鍵分子,可作為生物標志分子之一預測牛的妊娠結局。有關PLAC8的生殖生物學功能研究尚處于起步階段,PLAC8在人類早期胚胎的表達、定位及胚胎早期植入過程中是否表達目前尚無人報道。研究目的在分子與細胞水平探究PLAC8在人類早期胚胎發(fā)育和體外植入過程中的表達,為進一步功能研究提供理論支持。研究方法利用人體外受精-胚胎移植過程中分級標準達不到移植和冷凍要求的廢棄的患者自愿捐贈用于科學研究的卵母細胞和胚胎,通過預實驗摸索確定采用少量細胞RNA提取試劑盒提取單個卵子、2-細胞期胚胎、4-細胞期胚胎、8-細胞期胚胎、桑椹胚和囊胚的RNA,總樣本33個,包括3個卵母細胞,每一時期胚胎各6個(正常受精、異常受精各3個),進一步通過熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR)進行定量分析,檢測PLAC8 mRNA在不同時期的人類早期胚胎中的表達;同時通過胚胎免疫熒光染色技術,進行不同時期的人類早期胚胎PLAC8蛋白表達的檢測,共檢測53個人類卵母細胞／胚胎,包括12個卵母細胞,4個2-細胞期胚胎,4個4-細胞期胚胎,8個8-細胞期胚胎,7個桑椹胚和18個囊胚,明確PLAC8蛋白在著床前胚胎中的時空表達;建立穩(wěn)定的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞-人胚胎共培養(yǎng)的體外植入模型,觀察25枚解凍并經(jīng)輔助孵化后完全孵出的人類囊胚的體外植入過程,通過免疫熒光染色技術檢測共培養(yǎng)模型中發(fā)生植入的胚胎PLAC8蛋白是否表達及其表達模式。結果1、首次對PLAC8 mRNA在人類不同發(fā)育階段的早期胚胎的表達進行了單胚胎定量分析。在卵母細胞、2-細胞期胚胎、4-細胞期胚胎、8-細胞期胚胎、異常受精桑椹胚中,未檢測到PLAC8 mRNA的表達,正常受精桑椹胚PLAC8 mRNA的檢出率為33%,囊胚檢出率為100%。正常和異常受精囊胚PLAC8 mRNA相對表達量無統(tǒng)計學差異。在人類早期胚胎發(fā)育過程中,蛋白酶體亞基β6 (PSMB6)比肌動蛋白ACTB(β-actin)表達更穩(wěn)定。2、首次對PLAC8蛋白在人類早期胚胎的表達進行了定位。PLAC8蛋白在所有人類卵母細胞和不同發(fā)育階段的早期植入前胚胎均有表達(陽性率100%),主要分布在細胞質(zhì),熒光強度由細胞膜及膜下區(qū)域向細胞核周圍逐漸減弱,細胞核內(nèi)未見熒光信號。3、成功構建了人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞-人類囊胚共培養(yǎng)體外植入模型。采用0.5mmol/l的8-Br-cAMP和1.0μmol/l的MPA聯(lián)合誘導蛻膜化,總的蛻膜化時間96h。4、應用體外植入模型首次對PLAC8蛋白在人類早期胚胎體外植入過程中的表達進行了研究和定位。PLAC8蛋白在人類囊胚體外植入過程中發(fā)生植入并擴展的囊胚有明顯表達,分布于細胞質(zhì)和細胞核核仁區(qū)。結論1、PLAC8 mRNA隨著人類胚胎發(fā)育至桑椹胚出現(xiàn)表達,囊胚100%表達。PSMB6是更好的內(nèi)參基因的選擇。PLAC8蛋白在人類卵母細胞和不同發(fā)育階段的早期植入前胚胎均有表達,主要分布在細胞質(zhì)。2、人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞-人類囊胚共培養(yǎng)模型是體外研究人類胚胎植入過程的有力工具。3、PLAC8蛋白在人類囊胚體外植入過程中有表達且定位發(fā)生變化,與胚胎的植入狀態(tài)相關。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.8

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本文編號：2306462