【摘要】：研究背景胎盤(pán)特異性抗原8 (placenta-specific 8, PLAC8),是近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)的在小鼠胎盤(pán)富集的生物分子。PLAC8被報(bào)道參與斑馬魚(yú)的早期胚胎發(fā)育和小鼠的胎盤(pán)發(fā)育。國(guó)外多項(xiàng)研究結(jié)果表明,PLAC8可能是牛胚胎著床過(guò)程中的關(guān)鍵分子,可作為生物標(biāo)志分子之一預(yù)測(cè)牛的妊娠結(jié)局。有關(guān)PLAC8的生殖生物學(xué)功能研究尚處于起步階段,PLAC8在人類(lèi)早期胚胎的表達(dá)、定位及胚胎早期植入過(guò)程中是否表達(dá)目前尚無(wú)人報(bào)道。研究目的在分子與細(xì)胞水平探究PLAC8在人類(lèi)早期胚胎發(fā)育和體外植入過(guò)程中的表達(dá),為進(jìn)一步功能研究提供理論支持。研究方法利用人體外受精-胚胎移植過(guò)程中分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)達(dá)不到移植和冷凍要求的廢棄的患者自愿捐贈(zèng)用于科學(xué)研究的卵母細(xì)胞和胚胎,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索確定采用少量細(xì)胞RNA提取試劑盒提取單個(gè)卵子、2-細(xì)胞期胚胎、4-細(xì)胞期胚胎、8-細(xì)胞期胚胎、桑椹胚和囊胚的RNA,總樣本33個(gè),包括3個(gè)卵母細(xì)胞,每一時(shí)期胚胎各6個(gè)(正常受精、異常受精各3個(gè)),進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR)進(jìn)行定量分析,檢測(cè)PLAC8 mRNA在不同時(shí)期的人類(lèi)早期胚胎中的表達(dá);同時(shí)通過(guò)胚胎免疫熒光染色技術(shù),進(jìn)行不同時(shí)期的人類(lèi)早期胚胎PLAC8蛋白表達(dá)的檢測(cè),共檢測(cè)53個(gè)人類(lèi)卵母細(xì)胞／胚胎,包括12個(gè)卵母細(xì)胞,4個(gè)2-細(xì)胞期胚胎,4個(gè)4-細(xì)胞期胚胎,8個(gè)8-細(xì)胞期胚胎,7個(gè)桑椹胚和18個(gè)囊胚,明確PLAC8蛋白在著床前胚胎中的時(shí)空表達(dá);建立穩(wěn)定的人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞-人胚胎共培養(yǎng)的體外植入模型,觀察25枚解凍并經(jīng)輔助孵化后完全孵出的人類(lèi)囊胚的體外植入過(guò)程,通過(guò)免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)模型中發(fā)生植入的胚胎PLAC8蛋白是否表達(dá)及其表達(dá)模式。結(jié)果1、首次對(duì)PLAC8 mRNA在人類(lèi)不同發(fā)育階段的早期胚胎的表達(dá)進(jìn)行了單胚胎定量分析。在卵母細(xì)胞、2-細(xì)胞期胚胎、4-細(xì)胞期胚胎、8-細(xì)胞期胚胎、異常受精桑椹胚中,未檢測(cè)到PLAC8 mRNA的表達(dá),正常受精桑椹胚PLAC8 mRNA的檢出率為33%,囊胚檢出率為100%。正常和異常受精囊胚PLAC8 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在人類(lèi)早期胚胎發(fā)育過(guò)程中,蛋白酶體亞基β6 (PSMB6)比肌動(dòng)蛋白ACTB(β-actin)表達(dá)更穩(wěn)定。2、首次對(duì)PLAC8蛋白在人類(lèi)早期胚胎的表達(dá)進(jìn)行了定位。PLAC8蛋白在所有人類(lèi)卵母細(xì)胞和不同發(fā)育階段的早期植入前胚胎均有表達(dá)(陽(yáng)性率100%),主要分布在細(xì)胞質(zhì),熒光強(qiáng)度由細(xì)胞膜及膜下區(qū)域向細(xì)胞核周?chē)饾u減弱,細(xì)胞核內(nèi)未見(jiàn)熒光信號(hào)。3、成功構(gòu)建了人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞-人類(lèi)囊胚共培養(yǎng)體外植入模型。采用0.5mmol/l的8-Br-cAMP和1.0μmol/l的MPA聯(lián)合誘導(dǎo)蛻膜化,總的蛻膜化時(shí)間96h。4、應(yīng)用體外植入模型首次對(duì)PLAC8蛋白在人類(lèi)早期胚胎體外植入過(guò)程中的表達(dá)進(jìn)行了研究和定位。PLAC8蛋白在人類(lèi)囊胚體外植入過(guò)程中發(fā)生植入并擴(kuò)展的囊胚有明顯表達(dá),分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核核仁區(qū)。結(jié)論1、PLAC8 mRNA隨著人類(lèi)胚胎發(fā)育至桑椹胚出現(xiàn)表達(dá),囊胚100%表達(dá)。PSMB6是更好的內(nèi)參基因的選擇。PLAC8蛋白在人類(lèi)卵母細(xì)胞和不同發(fā)育階段的早期植入前胚胎均有表達(dá),主要分布在細(xì)胞質(zhì)。2、人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞-人類(lèi)囊胚共培養(yǎng)模型是體外研究人類(lèi)胚胎植入過(guò)程的有力工具。3、PLAC8蛋白在人類(lèi)囊胚體外植入過(guò)程中有表達(dá)且定位發(fā)生變化,與胚胎的植入狀態(tài)相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R714.8

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本文編號(hào)：2306462