【摘要】：鉑類耐藥是卵巢癌治療的一大難題,其發(fā)生機制及如何逆轉耐藥是多年來研究的熱點。近年來人們發(fā)現(xiàn)一些與靶點作用無關,卻與腫瘤耐藥相關的影響因素,例如自噬、Nrf2分子等。但是,這些因素參與卵巢癌耐藥的機制尚不明了。因此,深入研究相關機制為尋找潛在靶點具有重要的臨床意義。自噬(autophagy)是一種不同于凋亡的程序性死亡。當缺氧或饑餓時,細胞可形成雙層皺褶包裹受損的細胞器及大分子物質,利用自身溶酶體進行消化,維持能量代謝平衡。自噬功能的異�？蓪е录膊〉陌l(fā)生,如衰老、神經(jīng)退行性病變等。自噬與腫瘤的研究頗具爭議,部分研究表明自噬可抑制腫瘤形成,而其他研究認為自噬可促進腫瘤生長。自噬與腫瘤耐藥的研究有相似的現(xiàn)象,不同的是大部分研究表明自噬活性增高與腫瘤耐藥相關,而小部分實驗表明耐藥可損傷自噬功能。但自噬與卵巢癌耐藥關系如何,罕見報道。Nrf2-ARE信號通路(NF-E2-related factor 2-antioxidant response element)是存在細胞中抗氧化應激的信號通路。當細胞受到氧化應激時,Nrf2分子高表達從而引起下游抗氧化反應元件的活化,發(fā)揮保護細胞的功能。近年研究表明高表達的Nrf2分子與腫瘤耐藥相關。我們課題組前期工作發(fā)現(xiàn)耐藥的卵巢癌細胞高表達Nrf2,下調Nrf2水平可提高細胞對順鉑的敏感性。但是Nrf2-ARE信號通路參與卵巢癌鉑類耐藥的分子機制不十分清楚。綜上,我們課題組假想自噬與Nrf2-ARE信號通路在卵巢癌耐藥中可能存在某種調節(jié)。本課題主要研究自噬及Nrf2-ARE信號通路在卵巢癌鉑類耐藥中的作用及初步探討二者之間可能存在的調節(jié)機制。第一部分 自噬在卵巢癌鉑類耐藥中的相關性研究目的：探討自噬對卵巢癌細胞鉑類敏感性的影響。方法：以卵巢癌敏感細胞A2780及耐藥細胞A2780cp為主要研究對象,經(jīng)或不經(jīng)順鉑處理后,通過Western blot、免疫熒光及電鏡比較兩種細胞間的自噬水平。對自噬水平高的細胞,通過自噬藥物抑制劑3-MA或重要自噬基因beclin 1 siRNA轉染下調自噬水平,檢測細胞對順鉑敏感性及凋亡水平的改變。結果：耐藥細胞A2780cp對順鉑的24小時半數(shù)抑制濃度是敏感細胞A2780的6.5倍,為卵巢癌鉑類耐藥研究提供了理想的研究模型。A2780cp細胞中自噬蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ、beclin1蛋白表達顯著高于A2780細胞；A2780cp細胞中免疫熒光LC3表達高于A2780細胞；在相同處理條件下,A2780cp細胞中自噬小體的數(shù)量顯著多于A2780細胞。經(jīng)3-MA與順鉑聯(lián)合處理,A2780cp細胞對順鉑的敏感性顯著增加,但對順鉑引起的凋亡無明顯改變；經(jīng)beclin 1 siRNA轉染下調自噬水平后,A2780cp細胞對順鉑的敏感性及凋亡均顯著增加。結論：卵巢癌耐藥細胞的自噬水平高于敏感細胞。下調自噬水平,可增加耐藥細胞對順鉑的敏感性。第二部分Nrf2-ARE信號通路在卵巢癌鉑類耐藥的作用及對自噬潛在調控機制的初步探討目的：探討Nrf2-ARE信號通路對卵巢癌細胞順鉑敏感性的影響及與自噬可能的調控機制。方法：通過Real-time PCR及Western blot方法比較卵巢癌敏感細胞A2780及耐藥細胞A2780cp中Nrf2-ARE信號通路中重要基因Nrf2、Keap1、NQ01及HO-1中的表達差異。對于Nrf2高表達的細胞,經(jīng)Nrf2 siRNA轉染后檢測細胞存活率及凋亡水平的改變。同時檢測Nrf2 siRNA轉染后細胞自噬水平發(fā)生的變化。結果：在mRNA水平,耐藥細胞A2780cp中Nrf2、Keap1、NQO1及HO-1表達水平均高于敏感細胞A2780(除NQO1外,其他P0.05)、Western blot結果與mRNA相一致。經(jīng)Nrf2 siRNA下調耐藥細胞中Nrf2水平,NQO1、HO-1表達水平隨之下調,A2780cp細胞對順鉑的敏感性增加,同時Tune1染色后凋亡小體形成數(shù)目顯著增多,流式細胞儀檢測的由順鉑誘導的凋亡水平明顯增加。前已證實耐藥細胞中自噬水平高于敏感細胞,通過Western blot檢測自噬相關蛋白,耐藥細胞A2780cp中Atg3、Atg5、Atgl2及p62的表達均高于A2780。在A2780cp細胞中,Nrf2 siRNA轉染后,自噬基因Atg3、Atg5、Atg6、Atg12及p62在mRNA及蛋白水平均隨之下降,同時Nrf2下調后細胞的自噬小體形成數(shù)目顯著減少。結論：卵巢癌耐藥細胞中Nrf2-ARE信號通路活性高于敏感細胞。下調Nrf2水平,可增加細胞對順鉑的敏感性及凋亡水平。同時,Nrf2-ARE信號通路可能通過激活自噬參與卵巢癌鉑類耐藥的產(chǎn)生。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【共引文獻】

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本文編號：2291411