【摘要】：第一章月經(jīng)血子宮內(nèi)膜干細(xì)胞促進小鼠子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)的研究目的:探討月經(jīng)血子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(MenSCs)修復(fù)受損子宮內(nèi)膜的能力及可能的作用機制,為臨床治療子宮內(nèi)膜損傷提供理論基礎(chǔ)。材料與方法:1、選擇健康6-7周ICR小鼠131只,通過電熱損傷小鼠右側(cè)子宮內(nèi)膜,建立小鼠子宮內(nèi)膜損傷模型。于建立模型后3天,將子宮內(nèi)膜損傷小鼠隨機分為MenSCs移植組(n=75),生理鹽水組(n=56),經(jīng)尾靜脈注射干細(xì)胞或者生理鹽水。2、采用Dil標(biāo)記MenSCs進行干細(xì)胞移植后的體內(nèi)示蹤,分別于移植后3天(MenSCs移植組n=13,生理鹽水組n=12),7天(MenSCs移植組n=17,生理鹽水組n=16),14天(MenSCs移植組n=13,生理鹽水組n=11),通過小動物成像儀觀察MenSCs的歸巢情況,HE染色檢測子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu),測量子宮內(nèi)膜厚度;免疫組織化學(xué)檢測子宮內(nèi)膜微血管密度(MVD)標(biāo)志蛋白CD34的表達。3、于移植后7天,將雌雄ICR小鼠與雄性小鼠合籠(MenSCs移植組n=28,生理鹽水組n=14),評估MenSCs對小鼠受損子宮內(nèi)膜生育能力的影響。結(jié)果:1、電熱可破壞子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì),造成子宮內(nèi)膜變薄、宮腔狹窄,引起小鼠生育能力下降,可有效建立子宮內(nèi)膜損傷模型,較好的模擬了人類子宮內(nèi)膜損傷。2、子宮內(nèi)膜厚度及微血管密度比較:移植3天后MenSCs移植組和生理鹽水組子宮內(nèi)膜厚度和MVD沒有明顯差異(厚度:298.26±135.15μm vs 268.46±72.19μm,P=0.414,MVD:0.24±0.04 vs 0.38±0.05,P=0.058),然而移植 7天后MenSCs移植組子宮內(nèi)膜厚度和MVD明顯高于生理鹽水組(厚度:252.12±78.58μm vs 137.97±61.56μm,P=0.010,MVD:0.32±0.03 vs 0.96±0.03,P=0.000)。移植14天后兩組子宮內(nèi)膜厚度和微血管密度沒有明顯差異。3、生育力比較:MenSCs移植組損傷側(cè)小鼠妊娠率為15/28(53.57%),生理鹽水組為2/14(14.29%),差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.014)。經(jīng)MenSCs治療后損傷側(cè)平均胚胎數(shù)目為3.0357 ± 0.5986,生理鹽水組為0.8571 ± 0.661,差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030)。結(jié)論:MenSCs移植有利于子宮內(nèi)膜損傷后的修復(fù),不僅能夠增加子宮內(nèi)膜厚度,而且能夠改善受損子宮內(nèi)膜的生育能力,其中可能的機制為MenSCs的促血管形成作用,為臨床探索子宮內(nèi)膜損傷和宮腔粘連的治療方法提供新的方向。第二章月經(jīng)血子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞通過AKT和ERK途徑促進血管生成的研究目的:探索月經(jīng)血子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(MenSCs)旁分泌作用對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的血管生成作用及其分子機制。材料和方法:MenSC培養(yǎng)24小時或者48小時后收集條件培養(yǎng)基(CM)。通過細(xì)胞計數(shù)實驗-8分析(CCK8),AlexaFluor 488 Annexin/Dead凋亡試驗,劃痕修復(fù)試驗和基質(zhì)膠管血管形成試驗觀察分析CM或?qū)φ战M(DMEM/F12)對HUVEC增殖,凋亡,遷移和血管生成的作用;并且通過小鼠基質(zhì)栓試驗體內(nèi)觀察CM對內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成的作用。此外通過蛋白電泳分析CM或?qū)φ战M對HUVECs中的磷酸化和總AKT,P38,JNK,ERK表達水平的影響。此外,應(yīng)用Q-PCR來確定AKT和ERK的下游與血管生產(chǎn)相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄水平,包括VEGF家族,Ang家族和eNOS。結(jié)果:MenSCs-CM能夠促進臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力,抑制其凋亡。與對照組相比,Matrigel血管生成實驗發(fā)現(xiàn)MenSCs-CM處理HUVECs 4個小時后有明顯的血管形成;定量分析成環(huán)數(shù),血管面積和血管長度發(fā)現(xiàn)CM組和對照組之間有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。同時Matrigel血管形成試驗發(fā)現(xiàn)CM組有更多的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及小血管形成。同樣,體內(nèi)試驗我們觀察到MenSCs-CM更能促進內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管形成。此外,我們發(fā)現(xiàn)MenSCs-CM可以上調(diào)HUVECs中的AKT及ERK磷酸化水平,但對JNK和P38磷酸化水平?jīng)]有影響。進一步定量PCR分析發(fā)現(xiàn):與對照組相比,HUVECs經(jīng)MenSCs-CM處理后AKT及ERK下游靶基因eNOS、VEGFA、VEGFR1、VEGFR2的表達水平明顯升高。結(jié)論:MenSCs-CM可以提高AKT和ERK的磷酸化,增加與血管生成相關(guān)的靶基因,包括VEGF,VEGFR,eNOS的表達,并進一步刺激HUVECs增殖,抑制凋亡,促進HUVEC的遷移和血管生成�？偠灾�,我們的研究表明MenSCs旁分泌作用能夠促進內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成,為臨床治療子宮內(nèi)膜損傷等缺血性疾病提供基礎(chǔ)。第三章月經(jīng)血子宮內(nèi)膜干細(xì)胞改善子宮內(nèi)膜纖維化的作用研究目的:探索Hh信號通路在子宮內(nèi)膜纖維化過程中作用,并研究MenSCs在子宮內(nèi)膜纖維化中的作用。材料和方法:qRT-PCR分析宮腔粘連患者子宮內(nèi)膜中Gli2和纖維化相關(guān)蛋白關(guān)系的關(guān)系;并通過過表達和抑制實驗驗證Gli2對ESCs細(xì)胞周期和纖維化水平的作用。收集MenSCs培養(yǎng)液分析MenSCs旁分泌作用對間質(zhì)細(xì)胞(ESCs)中Gli2及纖維化水平的作用。結(jié)果:我們證明首次證實轉(zhuǎn)錄因子Gli2在子宮內(nèi)膜纖維化中發(fā)揮重要作用,過表達Gli2可促進間質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞周期的進程,促進上調(diào)纖維化水平;而smo抑制劑cyclopamine可抑制ESCs細(xì)胞周期的進程并減低纖維化。此外,MenSC-CM還可下調(diào)Gli2的表達,誘導(dǎo)ESCs中的細(xì)胞周期停滯并阻止纖維化相關(guān)蛋白表達。結(jié)論:轉(zhuǎn)錄因子Gli2在子宮內(nèi)膜纖維化過程中起促進作用;MenSCs旁分泌作用能夠抑制Gli2表達從而達到抗纖維化的作用。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R711.74

【參考文獻】

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1 Xiao-zhou MOU;Jian LIN;Jin-yang CHEN;Yi-fei LI;Xiao-xing WU;Bing-yu XIANG;Cai-yun LI;Ju-ming MA;Charlie XIANG;;Menstrual blood-derived mesenchymal stem cells differentiate into functional hepatocyte-like cells[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2013年11期

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本文編號：2284621