【摘要】：研究背景與方法胎盤(pán)是胚胎發(fā)育中最早形成的臨時(shí)性器官,又是妊娠時(shí)期最重要的內(nèi)分泌器官,一旦胎盤(pán)分泌激素不足或者紊亂,將會(huì)導(dǎo)致胎兒和母體的各種疾病。在胎盤(pán)合成的所有甾體激素中,孕酮(P4)和雌二醇(E2)是最重要的。胎盤(pán)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位是胎盤(pán)絨毛膜絨毛,它主要由合體滋養(yǎng)層、細(xì)胞滋養(yǎng)層、絨毛膜間質(zhì)和胎兒血管內(nèi)皮組成。合體化是發(fā)生于人類(lèi)胎盤(pán)中的一種細(xì)胞-細(xì)胞融合類(lèi)型,是指單核的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合形成多核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞的過(guò)程,是胎盤(pán)正常形態(tài)學(xué)和胎盤(pán)功能維持的前提條件;同時(shí),胎盤(pán)激素的分泌也和滋養(yǎng)層的合體化密切相關(guān)。Hedgehog(H)基因是一種最初在果蠅里發(fā)現(xiàn)的分節(jié)極性基因。哺乳動(dòng)物中存在三個(gè) Hedgehog 的同源基因:Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(1HH)和Desert Hedgehog(DHH),分別編碼SHH、IHH和DHH蛋白。HH信號(hào)傳遞受靶細(xì)胞膜上兩種受體Patched(PTC)和Smoothened(SMO)的控制。正常情況下,PTC抑制SMO蛋白的活性,從而抑制下游通路,這時(shí)下游的GLI蛋白在蛋白酶體(Proteasome)內(nèi)被截?cái)?并以羧基端被截?cái)嗟男问?GLI-AC)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄;而當(dāng)PTC和HH結(jié)合以后,PTC對(duì)SMO的抑制作用被解除,從而使全長(zhǎng)的GLI蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),HH信號(hào)中的關(guān)鍵分子在小鼠的胎盤(pán)中顯著表達(dá),同時(shí)SHH基因的缺失造成小鼠胎盤(pán)發(fā)育缺陷,導(dǎo)致胎鼠發(fā)育障礙,這證實(shí)SHH在小鼠胎盤(pán)中發(fā)揮巨大的作用。然而,HH信號(hào)對(duì)人胎盤(pán)的效應(yīng)及其分子機(jī)制尚未知曉。本課題采用人胎盤(pán)組織和人胎盤(pán)來(lái)源的細(xì)胞系,通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、免疫熒光染色、組織HE染色、體外胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞分離與培養(yǎng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、WesternBlot、蛋白過(guò)表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、蛋白質(zhì)鄰位連接試驗(yàn)、蛋白質(zhì)半衰期測(cè)定試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附法、慢病毒介導(dǎo)的的基因敲降、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)、細(xì)胞融合指數(shù)的測(cè)定、蛋白質(zhì)免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀和裸鼠的移植瘤模型等實(shí)驗(yàn)技術(shù),研究了 HH信號(hào)對(duì)人胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞甾體激素合成和合體化的效應(yīng)及其分子機(jī)制。研究結(jié)果1.HH信號(hào)中的關(guān)鍵分子在人胎盤(pán)組織中均有表達(dá)。其中,DHH和IHH均大量表達(dá)于絨毛錐和滋養(yǎng)層細(xì)胞層,而SHH在絨毛錐和滋養(yǎng)層細(xì)胞層的表達(dá)量則較低。兩個(gè)受體蛋白PTC和SMO主要表達(dá)于滋養(yǎng)層細(xì)胞層,而轉(zhuǎn)錄因子GLI2和GLI3則均大量表達(dá)于絨毛錐和滋養(yǎng)層細(xì)胞層。但是,轉(zhuǎn)錄因子GLI1在胎盤(pán)中的表達(dá)較弱。2.激活HH信號(hào)可顯著促進(jìn)人胎盤(pán)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(CTB,cytotrophoblast)和JEG-3細(xì)胞中膽固醇向孕酮(P4)和雌二醇(E2)等甾體激素的轉(zhuǎn)化;并且,SHH顯著地增加參與孕酮、雌二醇合成的三個(gè)關(guān)鍵酶P450scc、3P-HSD1和aromatase的mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。此外,激活HH信號(hào)可顯著促進(jìn)CTB和BeWo細(xì)胞的合體化,包括細(xì)胞融合指數(shù)的增加,融合基因及細(xì)胞合體化關(guān)鍵marker(syncytin-1和PP13等)的mRNA和蛋白水平的的升高,以及βHCG分泌量的增加。3.HH對(duì)甾體激素的合成及合體化的調(diào)控依賴(lài)受體蛋白SMO。抑制劑cyclopamine 劑量依賴(lài)地逆轉(zhuǎn) SHH 誘導(dǎo)的 P450scc,3β-HSD1 和 aromatase 的mRNA和蛋白表達(dá),同時(shí)顯著地抑制了 SHH誘導(dǎo)的P4和E2的合成;相反地,過(guò)表達(dá)SMO*(SMO氨基酸突變體,SMO的連續(xù)激活形式)可顯著上調(diào)P450scc,3β-HSD1和aromatase的 mRNA和蛋白表達(dá)并顯著促進(jìn)P4和E2的合成。此外,激動(dòng)劑purmorphamine或SMO*均能夠顯著地抑制ZO-1的mRNA和蛋白水平的表達(dá),而促進(jìn)PHCG的合成以及syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表達(dá);相反地,抑制劑cyclopamine顯著增加了 ZO-1的表達(dá),而抑制了 syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表達(dá),以及βHCG的合成。4.轉(zhuǎn)錄因子家族GLI蛋白在調(diào)控人胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞甾體激素合成和合體化中發(fā)揮著不同的作用。在甾體激素合成中,GLI3調(diào)控P450scc的轉(zhuǎn)錄,而GLI2則影響3β-HSD1和aromatase的轉(zhuǎn)錄。與這幾個(gè)酶的變化相一致,GLI2和GLI3調(diào)控P4的合成,而GLI2則調(diào)控E2的合成。在合體化中,GLI2對(duì)于HH調(diào)控的合體化是必需的。GLI2能夠調(diào)控ZO-1的mRNA和蛋白水平的表達(dá),βHCG的合成以及syncytin-1和PP13的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。前人的研究表明,GCMa在調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞合體化中發(fā)揮著不可或缺的作用;并且許多細(xì)胞融合基因(如syncytin-1)為GCMa的靶基因,GCMa可以通過(guò)促進(jìn)融合基因的表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)合體化。我們發(fā)現(xiàn),GLI2能夠與GCMa形成復(fù)合體從而顯著影響GCMa蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性;此外,轉(zhuǎn)錄復(fù)合體GLI2-GCMa對(duì)于滋養(yǎng)層細(xì)胞的合體化是必需的。5.發(fā)現(xiàn)GLI新的靶基因。雙熒光素酶報(bào)道基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)GLI2顯著地促進(jìn)3β-HSD1、aromatase和syncytin-1的啟動(dòng)子報(bào)道基因的活性,過(guò)表達(dá)△N-GLI3能夠顯著地促進(jìn)P4500scc啟動(dòng)子報(bào)道基因的活性。染色質(zhì)免疫共沉淀-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),GLI2能夠與3β-HSD1、aromatase和syncytin-1基因的啟動(dòng)子結(jié)合,而GLI3則能夠與P450scc的啟動(dòng)子結(jié)合。6.裸鼠移植瘤模型中的結(jié)果。為了進(jìn)一步明確HH調(diào)控的P4和E2的生理作用,我們?cè)诼殉睬谐穆闶笾兄踩肓巳颂ケP(pán)滋養(yǎng)層絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3來(lái)源的移植瘤,同時(shí)cyclopamine給藥。結(jié)果表明,移植了 JEG-3瘤的卵巢切除裸鼠子宮增大,子宮上皮平坦但明顯增厚,子宮內(nèi)膜腺體以及蛻膜了的基質(zhì)細(xì)胞增多,提示子宮的蛻膜化程度較高。低劑量的cyclopamine和高劑量的cyclopamine均不影響腫瘤的體積和重量,也沒(méi)有顯著影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。但是,cyclopamine劑量依賴(lài)地顯著抑制了小鼠血清中P4和E2水平,同時(shí),cyclopamine顯著降低了子宮濕重,抑制了子宮上皮的增厚,減少了基質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量以及子宮內(nèi)膜腺體的數(shù)量。因此,以上結(jié)果證實(shí),HH信號(hào)的抑制引起了 P4和E2的合成減少,導(dǎo)致子宮蛻膜化顯著減弱。結(jié)論我們的研究結(jié)果表明,在人胎盤(pán)組織中,HH信號(hào)通路的關(guān)鍵分子均有表達(dá)。HH通過(guò)不同的GLI轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控妊娠時(shí)期的不同事件:GLI2和GLI3分別通過(guò)促進(jìn)甾體激素合成酶3β-HSD1和aromatase,以及P450scc的轉(zhuǎn)錄從而誘導(dǎo)膽固醇向雌二醇、孕酮的轉(zhuǎn)變。此外,在滋養(yǎng)層細(xì)胞的合體化過(guò)程中,GLI2通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子GCMa結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄異源二聚體,從而增強(qiáng)了 GCMa的蛋白穩(wěn)定性與活性,同時(shí)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體GLI2-GCMa通過(guò)促進(jìn)融合基因syncytin-1等的轉(zhuǎn)錄進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的合體化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R714.5

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本文編號(hào)：2280108