研究目的： 1.分析HPV16/18E6/E7癌基因序列信息,構(gòu)建靶向于HPV16/18E6/E7不同靶點(diǎn)的TALEN質(zhì)粒,利用體外的報(bào)告系統(tǒng)初步篩選出切割效率最好而毒副作用最小的TALEN;同時(shí)對(duì)TALEN的FokI切割域和骨架系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化,篩選出切割效率最高的的TALEN。 2.再將TALEN應(yīng)用到各種細(xì)胞系中,從E6E7DNA拷貝數(shù)的變化、細(xì)胞內(nèi)靶序列的切割效率、癌蛋白表達(dá)情況、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞增殖等方面驗(yàn)證TALEN的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)和特異性。 3.以mRFP表達(dá)建立小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染體系,評(píng)價(jià)陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的基因表達(dá)、分布等情況,再以靶向EGFP的TALEN質(zhì)粒(TAL-EGFP)轉(zhuǎn)染到系統(tǒng)表達(dá)EGFP的轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi),利用EGFP熒光表達(dá)評(píng)價(jià)陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染TALEN的作用效果,以此優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系,為后續(xù)在轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)直接轉(zhuǎn)染靶向HPV的TALEN表達(dá)質(zhì)粒治療CIN或?qū)m頸癌建立基礎(chǔ),為CIN或?qū)m頸癌的治療與預(yù)防提供新的策略。 研究方法： 1.分析高危性HPV16和HPV18的E6E7癌基因序列,在E6E7癌基因翻譯起始點(diǎn)或主mRNA剪接體的起始外顯子之內(nèi)挑選出作用靶點(diǎn),利用Golden Gate Assembly的方法構(gòu)建TALEN質(zhì)粒共計(jì)16對(duì),隨后利用SSA reporter報(bào)告系統(tǒng)對(duì)所有的TALEN進(jìn)行篩選；突變野生型的FokI切割域,將FokI突變體和兩種TALEN骨架進(jìn)行組合并同樣用SSA reporter系統(tǒng)篩選效率最高毒副作用最小的組合方式進(jìn)行組裝優(yōu)化。 2.將優(yōu)化的TALEN分別轉(zhuǎn)入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T細(xì)胞系,利用T7E1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DSB用于間接反應(yīng)TALEN在細(xì)胞內(nèi)的切割效率;熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HPV E6E7基因的拷貝數(shù)變化;Western blotting檢測(cè)HPV16/18E6E7癌基因及其下游基因的蛋白表達(dá)情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 3.采用單次或多次不同劑量給藥的方式在小鼠陰道內(nèi)直接轉(zhuǎn)染mRFP表達(dá)質(zhì)粒,小鼠陰道脫落細(xì)胞直接鏡下觀察細(xì)胞發(fā)光情況,監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率；選取不同給藥劑量的不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠,取出小鼠宮頸陰道部組織,冰凍切片觀察紅色熒光在組織內(nèi)的分布情況,優(yōu)化陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染的條件；再按照此條件在EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染FLAG標(biāo)記的靶向EGFP的TAL-EGFP,取組織冰凍切片觀察EGFP綠光變化情況,再用4%多聚甲醛固定后石蠟包埋切片,通過(guò)攜帶的FLAG標(biāo)簽的免疫組化染色確定TAL-EGFP質(zhì)粒的表達(dá)在組織內(nèi)的分布情況。通過(guò)HE染色和小鼠CD45的免疫組化染色確定轉(zhuǎn)染是否誘導(dǎo)局部的炎癥。 研究結(jié)果： 1.經(jīng)過(guò)SSA reporter系統(tǒng)的篩選,所有構(gòu)建的16對(duì)TALEN質(zhì)粒均能有效的切割DNA,切割效率最好的分別是靶向于HPV16E6的T27,靶向于HPV16E7的T512,靶向于HPV18E6的T34和靶向于HPV18E7的T519；+63截短型骨架與S+KKR/ELD的突變型Fokl的組合的切割效率最高,因此將上述4對(duì)TALEN質(zhì)粒全部裝上這一骨架系統(tǒng)。 2.將優(yōu)化的4對(duì)TALEN分別轉(zhuǎn)入SiHa、HeLa、C33A、S12和293T細(xì)胞后,(1)T7E1實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)T27或T512處理的SiHa和S12細(xì)胞、T34或T519轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞樣品均得到陽(yáng)性的結(jié)果。(2)熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)T512轉(zhuǎn)染后的SiHa和S12細(xì)胞里的HPV16DNA拷貝數(shù)降低,T519處理后的HeLa細(xì)胞里的HPV18DNA拷貝數(shù)降低。(3) Western blotting結(jié)果顯示T27、T34能特異性的誘導(dǎo)HPV16E6和HPV18E6蛋白的下調(diào),同時(shí)檢測(cè)到E6下游的靶蛋白p53的上調(diào)；T512、T519能特異性的誘導(dǎo)HPV16E7和HPV18E7蛋白的下調(diào),以及E7下游的CDK2蛋白的表達(dá)上調(diào)。(4)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示T27和T512僅能引起HPV16陽(yáng)性的細(xì)胞系SiHa和S12的明顯凋亡,對(duì)HPV18陽(yáng)性的HeLa無(wú)明顯誘導(dǎo)凋亡作用；T34和T519僅能引起HeLa的凋亡,而對(duì)SiHa無(wú)明顯作用；所有這4對(duì)TALEN對(duì)HPV陰性的宮頸癌細(xì)胞系C33A和正常人胚腎細(xì)胞系293T都無(wú)誘導(dǎo)凋亡作用。(5)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示,T27和T512僅特異性的抑制SiHa和S12的細(xì)胞增殖,對(duì)HeLa、C33A、293T的生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用；T34和T519僅特異性的抑制HeLa的增殖,對(duì)其他4株細(xì)胞系均無(wú)明顯影響。 3. mRFP質(zhì)粒在小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染后48小時(shí)即可檢測(cè)到明顯的發(fā)光情況,并且至少6天內(nèi)可觀察到熒光；通過(guò)比較不同濃度不同轉(zhuǎn)染量的發(fā)光情況,對(duì)陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染體系進(jìn)一步的優(yōu)化；觀察到轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒表達(dá)范圍大部分限定在宮頸和陰道的上皮內(nèi)；陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染的TAL-EGFP可以在體內(nèi)有效的切割EGFP表達(dá)序列,阻止EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠陰道內(nèi)的EGFP蛋白的繼續(xù)表達(dá),使得宮頸陰道局部的EGFP熒光減弱甚至消失；證明體內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)局部無(wú)損傷,不會(huì)誘導(dǎo)急性炎性反應(yīng)。 研究結(jié)論： 1.對(duì)構(gòu)建出8對(duì)靶向于HPV16E6E7和8對(duì)靶向于HPV18E6E7的TALEN質(zhì)粒進(jìn)行篩選后得出效果最好的4對(duì)分別是靶向于HPV16E6的T27,靶向于HPV16E7的T512,靶向于HPV18E6的T34和靶向于HPV18E7的T519,并對(duì)FokI切割域和骨架系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化。 2.T27、T512、T34和T519在相應(yīng)HPV陽(yáng)性的細(xì)胞內(nèi)有效的切割靶向HPV序列,引起HPV拷貝數(shù)的降低,相應(yīng)HPV癌基因表達(dá)的下調(diào)以及下游p53或RB1通路的上調(diào),最終誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞的增殖,而對(duì)其他HPV亞型陽(yáng)性的細(xì)胞或HPV陰性的細(xì)胞無(wú)作用。 3.小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染TALEN質(zhì)�？梢杂行У竭_(dá)小鼠宮頸局部組織,有效地切割宮頸上皮組織內(nèi)的靶向序列,阻礙目的蛋白的表達(dá)。并且小鼠陰道內(nèi)轉(zhuǎn)染不引起陰道局部的急性炎癥反應(yīng),對(duì)局部組織無(wú)損傷,可以用于宮頸局部的基因治療。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2239443