【摘要】：研究背景與目的 β地中海貧血是p珠蛋白合成減少(β+)或缺失(βo),造成血紅蛋白(α2β2)生成障礙,導(dǎo)致無(wú)效造血和紅細(xì)胞破壞而產(chǎn)生溶血性貧血。p地中海貧血有三種臨床表型：攜帶者、中間型地中海貧血和重型地中海貧血。 β地中海貧血分子基礎(chǔ)是位于11號(hào)染色體短臂1區(qū)5帶5亞帶(11p15.5)位點(diǎn)上的p珠蛋白(HBB)缺陷所致。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)200多種突變類型,p地貧表型分為β0和p+兩種類型,β0地貧無(wú)珠蛋白產(chǎn)生,p+地貧有低于正常水平的p珠蛋白產(chǎn)生。在中國(guó)人群的p地貧突變中,中國(guó)南方地區(qū)有5類突變最為常見(jiàn),占突變類型的92.5%,分別是：(1)密碼子41-42(-TCTT),即在HBB基因第41和42密碼子區(qū)域出現(xiàn)4個(gè)核苷酸的缺失引起移碼突變,導(dǎo)致肽鏈合成提前終止,產(chǎn)生β0地貧；(2)IVS-2-654(C-T),使mRNA加工異常產(chǎn)生β+地貧；(3)TATA盒-28(A-G),使mRNA轉(zhuǎn)錄效率降低,從而使p珠蛋白鏈合成減少,產(chǎn)生p+地貧；(4)密碼子17(A-T),引起無(wú)義突變,生成無(wú)功能的mRNA,產(chǎn)生β0地貧；(5)異常血紅蛋白E,是異常血紅蛋白中最常見(jiàn)的一類結(jié)構(gòu)異常,導(dǎo)致中間型地貧。 目前,對(duì)于重型地中海貧血患者缺乏有效的治愈方法,因此對(duì)夫婦雙方為地中海貧血基因攜帶者的孕婦進(jìn)行地貧基因產(chǎn)前診斷(prenatal diagnosis),可有效預(yù)防地貧患兒的出生。 產(chǎn)前診斷是現(xiàn)代遺傳病診斷的重點(diǎn),也是臨床產(chǎn)科學(xué)的重要組成部分,是通過(guò)物理、生化和遺傳等診斷技術(shù)和方法,對(duì)胎兒的遺傳狀況進(jìn)行診斷,其主要目的在于為遺傳病風(fēng)險(xiǎn)家庭提供充足可靠的信息,使他們?cè)谌焉锲谧龀鲞m當(dāng)?shù)倪x擇。侵入性方法是獲取胎兒物質(zhì)最直接的方法,是目前產(chǎn)前診斷廣泛使用的方法之一,主要通過(guò)羊膜腔穿刺術(shù)、絨毛取樣術(shù)、臍靜脈血取樣術(shù)等方式獲取到充足的胎兒物質(zhì)用于遺傳學(xué)檢測(cè),但存在流產(chǎn)(0.2%-3%),絨毛膜炎,羊水滲漏,穿刺部位出血、感染,胎兒心動(dòng)過(guò)緩,胎膜早破等手術(shù)并發(fā)癥,增加孕婦風(fēng)險(xiǎn)同時(shí)加重孕婦及家屬焦慮情緒。因此大力發(fā)展無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷技術(shù)是臨床醫(yī)務(wù)工作者和科學(xué)研究者共同努力的方向。 從2007年發(fā)現(xiàn)母體血漿中存在胎兒游離DNA至今,p地中海貧血作為常染色體隱性遺傳性疾病的常見(jiàn)病之一被學(xué)者做為單基因疾病模型進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的方法學(xué)研究。最初采用飛行質(zhì)譜、AS-PCR等方法針對(duì)父母攜帶不同突變的胎兒進(jìn)行父源性突變等位基因排除性診斷,但該方法存在局限性：(1)不能對(duì)攜帶了父源性突變等位基因的胎兒行進(jìn)一步的診斷。(2)不能針對(duì)雙親攜帶相同突變的胎兒進(jìn)行診斷。 隨著數(shù)字化PCR、液滴數(shù)字化PCR以及第二代測(cè)序等絕對(duì)定量技術(shù)的出現(xiàn),及相對(duì)突變劑量(RMD)這一理論的提出,推進(jìn)了單基因疾病的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的發(fā)展,使得從cfDNA中鑒別胎兒是否遺傳了母源性突變位點(diǎn)成為現(xiàn)實(shí)。目前研究利用SNP的特點(diǎn),通過(guò)父母具有不同信息的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行RMD分析,通過(guò)序貫概率比檢驗(yàn)(SPRT)來(lái)判斷胎兒是否攜帶雙親的致病突變位點(diǎn),達(dá)到無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的目的。但SNPs作為第三代人類遺傳物質(zhì)標(biāo)簽,受人群、種族等因素影響,其等位基因的頻率存在差異性,因此,需要建立一組與地域、人群等相關(guān)的具有診斷價(jià)值的SNPs數(shù)據(jù)庫(kù),盡管目前可以通過(guò)液相雜交捕獲的方法獲取HBB基因上成千上萬(wàn)的SNP位點(diǎn),但捕捉芯片價(jià)格昂貴,不適合廣泛的臨床應(yīng)用。 鑒于以上技術(shù)方法的缺點(diǎn)和不足,本研究擬以地中海貧血為研究對(duì)象,采用PCR捕獲的方法對(duì)地貧突變基因位點(diǎn)進(jìn)行富集,應(yīng)用Illumina Miseq臺(tái)式高通量測(cè)序平臺(tái)建立一種快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法。p地中海貧血基因突變以點(diǎn)突變?yōu)橹?其中IVSII-654、CD41-42、CD17.-28和HbE5種突變最為常見(jiàn),由于-28和-29突變位點(diǎn)相鄰,可通過(guò)同一對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,因此本研究擬針對(duì)以上6種突變進(jìn)行設(shè)計(jì)引物,通過(guò)擴(kuò)增子對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集,富集后的片段經(jīng)Miseq深度測(cè)序。針對(duì)雙親攜帶不同突變位點(diǎn)的樣本,首先對(duì)父源性突變等位基因進(jìn)行排除性診斷,而后通過(guò)RMD結(jié)合SPRT方法對(duì)母源性突變位點(diǎn)進(jìn)行診斷。針對(duì)雙親攜帶相同突變位點(diǎn)的樣本直接通過(guò)RMD和SPRT方法對(duì)胎兒基因型進(jìn)行分析。本研究擬建立的方法簡(jiǎn)便、快捷有望實(shí)現(xiàn)地中海貧血無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的臨床轉(zhuǎn)化,推進(jìn)單基因疾病無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的臨床應(yīng)用,為我國(guó)的優(yōu)生優(yōu)育工作做出貢獻(xiàn)。 材料與方法 本研究對(duì)象為2012年1月至2013年1月分別到南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院、新加坡國(guó)立大學(xué)國(guó)立醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的144個(gè)計(jì)劃接受產(chǎn)前診斷的p地中海貧血家系,其中124個(gè)家系中雙親攜帶的p地貧突變位點(diǎn)涉及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的5個(gè)p地貧突變位點(diǎn)(IVSII-654、CD41-42、CD17、-28、-29)和HbE,將其納入進(jìn)一步研究。以上124個(gè)家系中,孕婦孕齡在10.57-32.14周,平均孕周20.29±0.36周；10例孕婦接受絨毛取樣術(shù),101例孕婦接受羊膜腔穿刺術(shù),13例孕婦接受臍靜脈穿刺術(shù)(產(chǎn)前診斷標(biāo)本收集標(biāo)準(zhǔn)：孕齡11-13+6周行絨毛取樣術(shù),16-24周行羊膜腔穿刺術(shù),24+1-32周行臍靜脈穿刺術(shù))。家系標(biāo)本收集包括孕婦外周血10ml(穿刺術(shù)前抽取),胎兒標(biāo)本(絨毛標(biāo)本1-2mg,羊水標(biāo)本5ml,臍靜脈血500u1),孕婦配偶外周血2ml。 采集孕婦外周血10ml,4℃保存6小時(shí)內(nèi)需進(jìn)行血漿分離：Eppendorf低溫離心機(jī)4℃,1600g離心10分鐘,小心將血漿轉(zhuǎn)移至2.0mlEP管內(nèi),避免擾動(dòng)血棕黃層。將裝有血漿的2.0mlEP管離心10分鐘,轉(zhuǎn)速16000g/min,將所得血漿轉(zhuǎn)移至新的EP管內(nèi)。血漿DNA采用QIAamp(?) Circulating Nucleic Acid試劑盒進(jìn)行手工提取。 母體血漿游離DNA經(jīng)PCR捕獲法對(duì)目的片段進(jìn)行富集,通過(guò)第二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)對(duì)其進(jìn)行深度測(cè)序,檢測(cè)內(nèi)容包括：(1)母體血漿DNA中胎兒DNA含量(fetal fraction)定量檢測(cè)：a.應(yīng)用性別決定區(qū)域的特異性位點(diǎn)ZFX/ZFY及INDEL多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)胎兒性別及胎兒游離DNA含量進(jìn)行檢測(cè)。ZFX/ZFY診斷標(biāo)準(zhǔn)：ZFY%4%為男性胎兒；ZFY%1%為女性胎兒,ZFY%介于1%-4%之間,為不能確定的結(jié)果；INDEL診斷標(biāo)準(zhǔn)：每個(gè)樣本至少包含2個(gè)或2個(gè)以上的有生物信息的INDEL多態(tài)性位點(diǎn),將胎兒游離DNA含量在4%-50%之間的IN/DEL信息納入胎兒游離DNA含量計(jì)算。(2)針對(duì)雙親攜帶不同型致病基因突變的胎兒基因型檢測(cè)：a.通過(guò)對(duì)母體血漿DNA中父源性突變位點(diǎn)的直接檢測(cè)可判斷胎兒是否攜帶父源性突變等位基因；b.對(duì)于cfDNA母源性突變等位基因檢測(cè),主要通過(guò)RMD和SPRT方法進(jìn)行分析。(3)針對(duì)雙親攜帶相同型致病基因突變的胎兒基因型檢測(cè)：基于胎兒DNA含量的定量檢測(cè),對(duì)cfDNA中致病基因的突變型和野生型進(jìn)行定量檢測(cè),測(cè)序結(jié)果通過(guò)RMD和SPRT分析對(duì)胎兒基因型進(jìn)行診斷。 結(jié)果中的計(jì)量資料除特別表述外,均表述為X±SD,樣本間的顯著性均用雙側(cè)檢驗(yàn)。通過(guò)兩種文庫(kù)構(gòu)建方法檢測(cè)所獲得的母體血漿中Y染色體含量的比較和ZFX/ZFY生物標(biāo)記與IN/DEL多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)胎兒含量檢測(cè)的比較選用配對(duì)t檢驗(yàn),兩種文庫(kù)構(gòu)建方法診斷率的比較、父源性排除性診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)以及母源性等位基因單倍型診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)比較采用配對(duì)x2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 以a=0.05為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)胎兒性別診斷及胎兒游離DNA定量檢測(cè)結(jié)果 在124個(gè)樣本中,長(zhǎng)引物和短引物同時(shí)診斷為男性52例,診斷為女性47例,均為不能確定性別的樣本7例。長(zhǎng)引物和短引物診斷中分別出現(xiàn)2例錯(cuò)誤結(jié)果。將兩方法進(jìn)行配對(duì)卡方檢驗(yàn)分析,提示兩種方法診斷胎兒性別的結(jié)果無(wú)顯著性差異,P0.05(P=0.255). 124例樣本胎兒游離DNA含量通過(guò)INDEL方法進(jìn)行檢測(cè),63例男性胎兒胎兒游離DNA含量均數(shù)為11.834±7.706。采用配對(duì)t檢驗(yàn)將IDNEL與ZFX/ZFY結(jié)果進(jìn)行比較,P0.05(t=-3.000,P=0.004),提示通過(guò)INDEL檢測(cè)的胎兒游離DNA含量與ZFX/ZFY檢測(cè)值存在顯著性差異,IN/DEL方法獲得的胎兒游離DNA含量較高。61例女性胎兒游離DNA含量分布范圍2.33%-20.9%,均值12.183±4.899.124個(gè)cfDNA樣本中,平均每個(gè)樣本包含11個(gè)有診斷價(jià)值的INDEL位點(diǎn)。 (2)母體血漿DNA中父源性突變位點(diǎn)的排除性診斷 在124個(gè)β地貧家系中,83(83/124,66.9%)個(gè)家系胎兒雙親攜帶不同β地貧突變位點(diǎn),2個(gè)家系父源性突變?yōu)?28和HbE雜合性突變,累計(jì)病例數(shù)為85例。本研究的PCR擴(kuò)增子平均每個(gè)堿基的測(cè)序深度讀數(shù)為460.002±430.854。 83例雙親攜帶不同突變位點(diǎn)的樣本進(jìn)行父源性突變等位基因診斷結(jié)果顯示33(33/83)例診斷為未攜帶父源性突變等位基因,可排除重型患兒的可能；47例診斷為攜帶了父源性突變等位基因,需進(jìn)一步行母源性等位基因單倍型分析；3例為假陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)本研究建立的重疊擴(kuò)增子深度測(cè)序的方法進(jìn)行父源性突變等位基因排除性診斷的準(zhǔn)確率為96.4%(80/83),該方法的靈敏度為100%,95%CI(92.4%-100%),特異性為91.67%,95%CI(78.17%-97.13%),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94%,95%CI(83.78%-97.94%),陰性預(yù)測(cè)值為100%,95%CI(89.57%-100%)。將Miseq診斷結(jié)果與RDB結(jié)果采用McNemar方法進(jìn)行比較,兩方法無(wú)顯著性差異,P0.05(P=0.250)。(3)雙親攜帶不同p地貧突變位點(diǎn)家系中母源性突變位點(diǎn)的診斷結(jié)果及雙親攜帶相同突變位點(diǎn)的cfDNA診斷結(jié)果 83例cfDNA樣本中,經(jīng)RMD結(jié)合SPRT分析方法進(jìn)行母源性突變位點(diǎn)檢測(cè),結(jié)果顯示47例樣本攜帶了母源性突變等位基因,36例排除了母源性突變等位基因的攜帶。與RDB結(jié)果相比較,7例為假陰性結(jié)果,8例為假陽(yáng)性結(jié)果,應(yīng)用RMD方法進(jìn)行母源性診斷方法的靈敏度84.78%,95%CI(71.78,92.43%)；特異性78.38%,95%CI(62.8%-88.61%)。陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別是82.98%,95%CI(69.86%-91.11%)；80.56%,95%CI(64.97%-90.25%)。將Miseq診斷結(jié)果與RDB結(jié)果采用McNemar方法進(jìn)行比較,兩方法無(wú)顯著性差異,P0.05(P=1.000)。 41個(gè)家系雙親攜帶相同的突變位點(diǎn),其診斷策略和診斷標(biāo)準(zhǔn)與母源性突變等位基因相同,結(jié)果顯示胎兒診斷為攜帶者20例,純合子患兒6例,正常個(gè)體15例；診斷率為75.61%,假陰性結(jié)果8例,假陽(yáng)性結(jié)果2例。將Miseq診斷結(jié)果與RDB結(jié)果采用McNemar方法進(jìn)行比較,兩方法無(wú)顯著性差異,P0.05(P=0.112)。 分析與討論 本研究通過(guò)INDEL多態(tài)性位點(diǎn)結(jié)合Y染色體特異性基因位點(diǎn)對(duì)母體血漿中胎兒游離DNA進(jìn)行定量檢測(cè),所選擇的45個(gè)INDEL多態(tài)性位點(diǎn)在中國(guó)南方人群中具有較高的雜合度,每個(gè)樣本平均有11個(gè)INDEL位點(diǎn)可提供可靠的生物信息,為女性胎兒游離DNA的定量檢測(cè)提供了可靠的理論基礎(chǔ)。本研究通過(guò)PCR方法對(duì)p地中海貧血常見(jiàn)的6個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行直接捕獲,目標(biāo)序列經(jīng)第二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行深度測(cè)序。從母體血漿中尋找父源性突變等位基因是目前最常用的排除重型地貧的有效的排除性診斷方法,其準(zhǔn)確率與所采用的定量檢測(cè)平臺(tái)相關(guān),本研究選用的illumina公司的NGS測(cè)序平臺(tái)具有高通量,絕對(duì)定量檢測(cè)等優(yōu)勢(shì),可準(zhǔn)確的對(duì)父源性突變位點(diǎn)進(jìn)行排除性診斷。本研究所建立的父源性突變位點(diǎn)排除性診斷方法的靈敏度為100%,95%CI(92.4%-100%),特異性為91.67%,95%CI(78.17%-97.13%),陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94%,95%CI(83.78%-97.94%),陰性預(yù)測(cè)值為100%,95%CI(89.57%-100%)。通過(guò)父源性突變位點(diǎn)篩查,可排除臨床約50%的重型胎兒,從而避免了行侵入性產(chǎn)前診斷。除此以外,該方法的優(yōu)勢(shì)還在于可以早期對(duì)胎兒游離DNA進(jìn)行診斷,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,可對(duì)孕5-7周的孕婦行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。對(duì)于母源性突變位點(diǎn)的胎兒基因型診斷,我們通過(guò)RMD和SPRT方法進(jìn)行分析,該方法方法的靈敏度84.78%,95%CI(71.78-92.43%)；特異性78.38%,95%CI(62.8-88.61%)。 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別是82.98%(69.86-91.11%)；80.56%(64.97-90.25%)。除此以外,該方法同時(shí)可對(duì)雙親攜帶相同突變位點(diǎn)的家系進(jìn)行分析,其診斷率為75.61%。導(dǎo)致母源性突變位點(diǎn)檢測(cè)出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的因素主要考慮：(1)胎兒游離DNA含量較低,增加檢測(cè)的錯(cuò)誤率；(2)PCR擴(kuò)增過(guò)程中可能出現(xiàn)的錯(cuò)配,導(dǎo)致后續(xù)的檢測(cè)出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果；(3)待檢測(cè)序列中的GC含量分布是導(dǎo)致測(cè)序發(fā)生錯(cuò)誤的一個(gè)關(guān)鍵因素,需要進(jìn)一步通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行修正。結(jié)論 本研究將建立的基于PCR捕獲特異性片段的NGS測(cè)序方法應(yīng)用于p地中海貧血的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷領(lǐng)域,通過(guò)對(duì)父源性突變等位基因進(jìn)行直接診斷,可排除50%的重型患兒,本方法的陰性預(yù)測(cè)值為100%,可準(zhǔn)確的預(yù)示未攜帶父源性突變等位基因的胎兒,避免了行侵入性產(chǎn)前診斷。對(duì)于攜帶了父源性突變等位基因的胎兒及雙親攜帶相同突變的胎兒可通過(guò)RMD和SPRT方法進(jìn)行母源性突變等位基因篩查,可降低侵入性診斷的風(fēng)險(xiǎn)。本研究所建立的方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率較高,有望成為單基因疾病無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的診斷模型廣泛應(yīng)用于其他單基因疾病的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 曾溢滔，任兆瑞，，黃淑幀;人類珠蛋白基因表達(dá)的遺傳控制[J];生物工程進(jìn)展;1994年01期

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本文編號(hào)：2187069