【摘要】：妊娠期胎盤是聯(lián)系母體和胎兒之間的樞紐，胎兒在子宮內(nèi)能否正常生長取決于跨胎盤營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)能否順利進(jìn)行。而胎盤的轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常常會導(dǎo)致一系列病理性妊娠的發(fā)生，對于母體和胎兒都有著極大的危害。氨基酸是妊娠期胎兒生長必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，，而胎盤細(xì)胞中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能對于胎兒生長發(fā)育更是至關(guān)重要。很多研究表明在妊娠合并胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩（Intrauterine Growth Retardation，IUGR）胎盤組織中A系、L系及TAUT氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性顯著降低，且A系氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體活性同胎兒出生體重呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，這提示胎盤細(xì)胞中三系氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能確實(shí)同宮內(nèi)胎兒的生長發(fā)育密切相關(guān)。 PPARγ是PPARs的一個(gè)亞型，屬于核受體超家族。許多研究均表明，PPARγ在人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育成熟及正常妊娠的維持過程中發(fā)揮著重要的作用，而PPARγ功能異常被認(rèn)為和許多病理性妊娠都密切相關(guān)。最近，Marta Díaz等人的報(bào)道顯示PPARγ受體在小于胎齡兒患者胎盤組織表明顯著減少，且表達(dá)水平同胎兒出生體重、胎盤重量呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。那么在人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞中，PPARγ受體對三系氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體各亞型的表達(dá)有無調(diào)控作用呢？為了闡明這一問題，我們進(jìn)行了本課題的研究。 我們以原代培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞為研究對象，利用PPARγ受體的激動劑羅格列酮及拮抗劑GW9662進(jìn)行處理，明確了PPARγ受體調(diào)控三系氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體各亞型表達(dá)的現(xiàn)象；然后，本文利用siRNA干擾技術(shù)證明了羅格列酮調(diào)控氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的過程是否通過PPARγ受體及RXR實(shí)現(xiàn)；接下來，本文利用熒光素酶報(bào)告基因及染色質(zhì)免疫共沉淀的技術(shù)探究了PPARγ調(diào)控三種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的具體機(jī)制；最后我們從臨床收集了胎盤組織樣本，檢測了不同出身體重胎兒對應(yīng)胎盤組織中三種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體及PPARγ受體的表達(dá)情況。從而從細(xì)胞核組織水平探討了PPARγ受體及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在妊娠期與胎兒生長發(fā)育間可能的聯(lián)系。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、PPAR γ對胎盤3系氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體各亞型表達(dá)的調(diào)控作用 采用原代培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)后，給予PPAR γ特異性激動劑羅格列酮處理細(xì)胞，利用realtime-PCR和Western blot方法檢測細(xì)胞中ATA1、ATA2、ATA4、LAT1、LAT2、TAUT mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，羅格列酮可時(shí)間及劑量依賴性上調(diào)LAT1、LAT2、TAUT的表達(dá)，而對ATA1、ATA2、ATA4表達(dá)無明顯的調(diào)節(jié)作用。 2、PPAR γ調(diào)節(jié)胎盤LAT1、LAT2、TAUT表達(dá)的機(jī)制研究 1、分別給予滋養(yǎng)層細(xì)胞PPAR γ受體拮抗劑GW9662、天然配體15d-PGJ2、高選擇激動劑GW1929處理細(xì)胞，結(jié)果15d-PGJ2及GW1929均可上調(diào)LAT1、LAT2、TAUT表達(dá)，GW9662可以逆轉(zhuǎn)羅格列酮的上調(diào)效應(yīng)；利用干擾技術(shù)敲低PPAR γ表達(dá)同樣可以逆轉(zhuǎn)羅格列酮的上調(diào)效應(yīng)。這些結(jié)果提示羅格列酮上調(diào)LAT1、LAT2、TAUT表達(dá)是通過PPAR γ受體實(shí)現(xiàn)的。 2、利用干擾技術(shù)敲低RXRa表達(dá)后，羅格列酮上調(diào)LAT1、LAT2、TAUT表達(dá)的現(xiàn)象也被逆轉(zhuǎn)了，提示羅格列酮上調(diào)LAT1、LAT2、TAUT表達(dá)的過程需要RXRa的參與。 3、利用蛋白合成抑制劑放線菌酮處理細(xì)胞，結(jié)果顯示，羅格列酮上調(diào)LAT1、TAUT的過程需要合成新的蛋白，而羅格列酮上調(diào)LAT2mRNA的效應(yīng)則不受CHX的影響。 4、利用SP-1抑制劑及干擾技術(shù)處理細(xì)胞，結(jié)果顯示SP-1抑制劑處理或者敲低SP-1表達(dá)均可逆轉(zhuǎn)羅格列酮上調(diào)LAT1、TAUT表達(dá)的現(xiàn)象，提示羅格列酮通過PPARγ受體上調(diào)LAT1、TAUT表達(dá)的過程需要SP1的參與。 5、利用染色質(zhì)免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)證實(shí)羅格列酮可促進(jìn)SP-1與LAT1、TAUT基因啟動子區(qū)結(jié)合，這提示羅格列酮通過促進(jìn)SP1表達(dá)及其與基因啟動子區(qū)結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮上調(diào)LAT1、TAUT表達(dá)的作用的。 3、小于胎齡兒、適于胎齡兒、大于胎齡兒胎盤中LAT1、LAT2、TAUT及PPARγ的表達(dá) 為了在組織水平驗(yàn)證小于胎齡兒、適于胎齡兒、大于胎齡兒胎盤組織中LAT1、LAT2、TAUT及PPAR γ的蛋白表達(dá)量是否存在差異，我們在臨床隨機(jī)收集了小于胎齡兒（15例）、適于胎齡兒（15例）、大于胎齡兒（14例）胎盤組織，利用Western blot方法檢測LAT1、LAT2、TAUT及PPARγ的表達(dá)，然后進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，與AGA及LGA組相比，SGA組LAT1、LAT2及PPARγ的蛋白表達(dá)顯著降低，而TAUT則無顯著差異；LAT1、LAT2、PPARγ的表達(dá)量與胎兒的出生體重均呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系，TAUT則無明顯相關(guān)性。且LAT1、LAT2及TAUT蛋白的表達(dá)同PPARγ表達(dá)呈正相關(guān)。 結(jié)論： 羅格列酮可以上調(diào)LAT1、LAT2及TAUT表達(dá)；羅格列酮上調(diào)LAT1、LAT2及TAUT表達(dá)是通過PPAR γ實(shí)現(xiàn)的，且需要RXRα的參與；羅格列酮通過促進(jìn)SP1表達(dá)及其與基因啟動子區(qū)結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮上調(diào)LAT1、TAUT表達(dá)的作用；羅格列酮激活PPAR γ后可直接促進(jìn)LAT2基因的轉(zhuǎn)錄；人胎盤組織中LAT1、LAT2及PPAR γ表達(dá)降低可能是導(dǎo)致小于胎齡兒的原因之一。
[Abstract]:The placenta in pregnancy is the junction between the mother and the fetus. The normal growth of the fetus in the uterus depends on whether the transplacental nutrient transport can be carried out smoothly. The abnormal transfer function of the placenta often leads to a series of pathological pregnancies, which have great harm to both the mother and the fetus. The function of amino acid transporters in placental cells is essential for fetal growth and development. Many studies have shown that the activity of A, L and TAUT amino acid transporters in the placental tissue of Intrauterine Growth Retardation (IUGR) is significantly reduced, and the amino group of A is amino acid. The relationship between the activity of acid transporter and fetal birth weight has a positive correlation, which suggests that the function of the three line amino acid transporter in the placental cells is closely related to the growth and development of the intrauterine fetus.
PPAR gamma is a subtype of PPARs and belongs to the nuclear receptor superfamily. Many studies have shown that PPAR gamma plays an important role in the development of human placental trophoblast cells and the maintenance of normal pregnancy. The abnormal PPAR gamma function is considered to be closely related to many pathological gestation. Recently, the reports of Marta D AZ and others show PPAR gamma The expression of PPAR gamma receptor in human placental trophoblast cells has a positive correlation with fetal birth weight and placental weight. So, in human placental trophoblast cells, is there a regulation effect on the expression of the subtypes of three series amino acid transporters in human placental trophoblast cells? To clarify this problem, we have done this lesson The study of the problem.
We use the original cultured human placental trophoblast cells as the research object, using the PPAR gamma receptor agonist rosiglitazone and antagonist GW9662 to clarify the expression of PPAR gamma receptor in the regulation of the expression of each subtype of the three line amino acid transporter. Then, this paper uses siRNA interference technique to prove that rosiglitazone regulates the amino acid transport body surface. Whether the process is realized by PPAR gamma receptor and RXR; then, this paper uses the luciferase reporter gene and chromatin immunoprecipitation technique to explore the specific mechanism of PPAR gamma regulation of the expression of three amino acid transporters. Finally, we collected samples of placental tissue from the clinic and detected the placental group of different body weight fetus. The expression of three amino acid transporters and PPAR gamma receptors in the weave, thus the possible relationship between the PPAR gamma receptor and the amino acid transporter in pregnancy and the growth and development of the fetus was discussed from the level of nuclear tissue.
The main experimental results are as follows:
1, PPAR gamma regulates the expression of 3 subtypes of placental amino acid transporters in placenta.
After 48 hours of primary cultured human placental trophoblast, PPAR gamma specific agonist rosiglitazone was used to treat cells. The expression of ATA1, ATA2, ATA4, LAT1, LAT2, TAUT mRNA and protein in cells was detected by realtime-PCR and Western blot. The expression of ATA1, ATA2 and ATA4 was not significantly regulated.
2, the mechanism of PPAR gamma regulating the expression of LAT1, LAT2 and TAUT in placenta
1, PPAR gamma receptor antagonist GW9662 of trophoblast cells, natural ligand 15d-PGJ2 and high selective agonist GW1929 are used to process cells. Results 15d-PGJ2 and GW1929 can up-regulation the expression of LAT1, LAT2, TAUT, and GW9662 can reverse the up-regulation effect of rosiglitazone; using interference technique to knock low PPAR gamma expression can also reverse the up-regulation effect of rosiglitazone. These results suggest that rosiglitazone upregulated LAT1, LAT2 and TAUT expression through PPAR gamma receptor.
2, using interference technique to knock down RXRa expression, rosiglitazone up-regulated LAT1, LAT2, and TAUT expression also reversed, suggesting that rosiglitazone up-regulated LAT1, LAT2, TAUT expression needs RXRa participation.
3, using the protein synthesis inhibitor actinomycone treatment cells, the results showed that rosiglitazone up regulation of LAT1, TAUT process needs to synthesize new proteins, while rosiglitazone up the effect of LAT2mRNA is not affected by CHX.
4, the cells were treated with SP-1 inhibitors and interference techniques. The results showed that SP-1 inhibitor treatment or low SP-1 expression could reverse the up-regulation of rosiglitazone on LAT1, TAUT expression, suggesting that rosiglitazone up-regulated LAT1 through PPAR gamma receptor. The process of TAUT expression requires the participation of SP1.
5, using chromatin immunoprecipitation experiments confirmed that rosiglitazone can promote the binding of SP-1 and LAT1, TAUT gene promoter region, which suggests that rosiglitazone promotes the expression of LAT1 and TAUT by promoting the expression of SP1 and its binding with the promoter region of the gene.
3, small for gestational age, suitable for gestational age, LAT1, LAT2, TAUT and PPAR gamma expression in placenta of large gestational age infants.
In order to verify the difference in the protein expression of LAT1, LAT2, TAUT and PPAR gamma in placenta tissues of fetal age infants at tissue level, we collected less than gestational age infants (15 cases) at random, suitable for gestational age children (15 cases), greater than fetal age (14 cases) placenta tissue, and LAT1, LAT by Western blot method. 2, the expression of TAUT and PPAR gamma, and then the statistical analysis. The results showed that the protein expression of LAT1, LAT2 and PPAR y in SGA group was significantly lower than that of AGA and LGA group, but TAUT was not significantly different. LAT1, LAT2, PPAR gamma expression was positively related to the birth weight of the fetus. The expression of white was positively correlated with the expression of PPAR gamma.
Conclusion:
Rosiglitazone can up regulate the expression of LAT1, LAT2 and TAUT; rosiglitazone up-regulated LAT1, LAT2 and TAUT expression is realized through PPAR gamma, and requires the participation of RXR a; rosiglitazone plays the role of up regulation of LAT1, TAUT expression by promoting SP1 expression and its combination with the promoter region of the gene; rosiglitazone can directly promote the activation of PPAR gamma after activating PPAR gamma. 2 the transcription of genes, the decrease of LAT1, LAT2 and PPAR gamma expression in human placenta may be one of the causes of small for gestational age infants.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2171906