本文選題：順鉑 + 子宮內(nèi)膜癌細胞　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜癌的生物學(xué)發(fā)生是一個十分復(fù)雜的過程。但其確切發(fā)病機制尚不明確。研究提示,某些突變基因、癌基因的異常激活或抑癌基因的失活可能在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。因此,如果在子宮內(nèi)膜癌的早期改變的發(fā)生階段能夠修復(fù)損傷的細胞成份,或者在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展階段能夠清除突變或損傷了的細胞成份,這將對子宮內(nèi)膜癌提供更有效的治療模式。因而尋找針對子宮內(nèi)膜癌更有效的抗癌方法與途徑,是近年來的研究熱點。自噬是生物體自身降解細胞內(nèi)損壞或折疊錯誤蛋白,完成受損細胞器清除,進而保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要方式,是一個古老的生物學(xué)現(xiàn)象,它廣泛存在于單細胞生物、植物細胞和哺乳動物體中。它在正常細胞發(fā)育、細胞對環(huán)境刺激改變的反應(yīng)以及哺乳動物腫瘤發(fā)生發(fā)展中占重要地位；在哺乳動物細胞中,是其清除癌細胞的重要手段之一。正常生理情況下,細胞自噬有利于細胞保持自穩(wěn)狀態(tài)；自噬是一個具有高度保守性的細胞代謝過程,它在營養(yǎng)缺乏、低氧、高熱或藥物誘導(dǎo)的情況下,能夠降解折疊錯誤的蛋白、長周期蛋白和胞質(zhì)內(nèi)細胞器,是維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要途徑。從生物功能上講,一方面,在發(fā)生應(yīng)激時,細胞自噬可以防止有毒或致癌的損傷蛋白質(zhì)和細胞器的累積,從而抑制細胞癌變；另一方面,腫瘤一旦形成,細胞自噬卻為癌細胞提供更豐富的營養(yǎng)物質(zhì),從而促進腫瘤繼續(xù)生長。綜上所述,細胞自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中具有兩面性。目前根據(jù)自噬發(fā)生過程不同可分為三類：大自噬(Macroautophagy),微自噬(Microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA),通常我們所指的自噬是大自噬,是細胞質(zhì)中損傷或老化的蛋白質(zhì)抑或細胞器以小泡形式轉(zhuǎn)運到溶酶體中進行消化降解的過程；微自噬：是溶酶體直接、主動吞噬胞漿成分的另外一種方式；分子伴侶介導(dǎo)的自噬：一些分子伴侶,如hsp70,幫助未折疊蛋白轉(zhuǎn)位入溶酶體。自噬是一個有大量小分子蛋白質(zhì)、細胞器及溶酶體參與的生物學(xué)過程,透射電鏡下觀察自噬體是人們在自噬過程中研究應(yīng)用較多的和比較明確的一種研究手段,自噬相關(guān)蛋白--微管相關(guān)蛋白輕鏈3蛋白(green fluorescent protein and microtubule associated protein 1 light chain 3 fusionprotein, MAPLC3)也是常常被用于研究自噬的檢測。在正常生理情況下,為了維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的目的,細胞自噬的基礎(chǔ)水平保持在一個比較低狀態(tài),但在某些“應(yīng)激”狀態(tài)下可以快速上調(diào),如營養(yǎng)缺乏、生長激素缺乏、高熱、藥物誘導(dǎo)、細胞內(nèi)出現(xiàn)過多的受損細胞器或代謝廢物等。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)通路是細胞生長和細胞增殖的重要調(diào)節(jié)因子。在人類中的同源基因是FRAP1 (FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1),在哺乳動物中稱為絲/蘇氨酸蛋白激酶。大量研究顯示mTOR信號途徑調(diào)控異常與細胞增殖密切相關(guān),是細胞增殖不可缺少的過程,能接受多種上游信號,如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK,能感受營養(yǎng)和能量的變化。許多腫瘤中可以發(fā)現(xiàn)mTOR通路過度表達。多種腫瘤細胞中,包括子宮內(nèi)膜癌細胞,常存在磷酸酰肌醇-3激酶(MAPK)、蛋白激酶B (AKT)及絲裂原激活蛋白激酶,這些酶的激活可促進腫瘤細胞增殖,病情發(fā)展。該信號通路參與細胞增殖、細胞凋亡、分化和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種細胞功能的調(diào)節(jié)。該通路中的PI3K活性增加常與多種癌癥相關(guān)。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是該通路中PI3K最常用的激動劑。細胞自噬是一系列相關(guān)基因嚴格調(diào)控的生物學(xué)過程,是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程。研究表明,自噬調(diào)控過程的異常與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。順鉑為子宮內(nèi)膜癌的一線化療藥物,其是否影響子宮內(nèi)膜癌細胞的自噬,及其機制仍亟待闡明。mTOR作為氨基酸、能量和營養(yǎng)狀態(tài)的感受器,激活或抑制其上游各種信號因子均可能引起其自身活性的變化,同時亦可通過自身調(diào)節(jié)下游自噬復(fù)合物的生成,從而發(fā)揮對細胞自噬的直接調(diào)控作用。因此,弄清mTOR通路在順鉑對子宮內(nèi)膜癌自噬的可能作用機制將有助于人類從分子水平上對子宮內(nèi)膜癌進行分析和治療。本實驗將研究在子宮內(nèi)膜癌中順鉑與自噬之間的關(guān)系及其發(fā)生機制,擬定在體外培養(yǎng)Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細胞,用不同濃度和不同時間順鉑處理ishikawa細胞,MTS檢測細胞活力,濃度梯度為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、 80μg/mL,每個濃度設(shè)為0 h、12 h、24 h、48 h、72h五個時間點。選出IC50劑量并確定下一步順鉑的藥物濃度及作用時間。選取20 μ g/mL,0 h、12 h、24h三個時間點進行分組,利用透射電鏡觀察自噬泡形成,并通過熒光顯微鏡觀察微管相關(guān)蛋白1輕鏈3融合蛋白(GFP-LC3)的熒光聚集情況,檢測順鉑能否誘導(dǎo)Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細胞發(fā)生自噬；應(yīng)用Westerblot檢測mTOR通路中的PI3K、AKT及mTOR蛋白的累積。為了進一步明確mTOR通路在順鉑對子宮內(nèi)膜癌自噬中的作用,應(yīng)用胰島素樣生長因子-1(PI3K激動劑,100ng/ml)與順鉑(20μg/mL,24 h)共培養(yǎng),利用透射電鏡觀察自噬泡形成,熒光顯微鏡觀察微管相關(guān)蛋白1輕鏈3融合蛋白(GFP-LC3)的熒光聚集情況檢測自噬。本研究闡明了順鉑對子宮內(nèi)膜癌細胞自噬的影響及其可能的作用機制,為子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的靶點并奠定實驗基礎(chǔ)。研究背景和目的研究背景1、子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐年上升。子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一種上皮性惡性腫瘤,是女性生殖道腫瘤中最常見的三大惡性腫瘤之一,以中老年婦女為多見。隨著肥胖人群增多、人類壽命的延長以及內(nèi)外源性激素使用的增多,其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢,由于宮頸篩查的普及,部分發(fā)達國家已超過宮頸癌。早期子宮內(nèi)膜腺癌手術(shù)效果好,五年生存率達90%以上,但如患者就診時已經(jīng)是晚期,預(yù)后差,五年生存率僅約30%,對于晚期及復(fù)發(fā)子宮內(nèi)膜癌患者,化療為其重要的治療手段,因此如何對晚期及復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的患者尋找合適的治療方案是非常重要且必要的。目前,從分子生物學(xué)的角度研究化療藥物對子宮內(nèi)膜癌的抗癌作用機制已成為學(xué)者們關(guān)注的一個焦點。2、自噬與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。自噬又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡(type II programmed cell death)是以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)包裹長壽命蛋白、折疊錯誤蛋白和老化細胞器的自噬小體為特征的細胞內(nèi)“自我消化”的一系列生化過程,是細胞在生理或病理(如饑餓、高熱、低氧或缺氧、藥物誘導(dǎo)等)的作用下形成具有獨立雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡；有研究顯示,不典型增生子宮內(nèi)膜細胞(癌前病變)其自噬活性比正常子宮內(nèi)膜增強,腺癌則自噬活性明顯減弱。根據(jù)自噬的演變過程,自噬一方面可以維持并促進腫瘤細胞生存,另一方面,細胞自噬在腫瘤的某些發(fā)展階段又能抑制腫瘤發(fā)生。作為機體的一種保護性機制,自噬活性增強,可能導(dǎo)致相關(guān)蛋白質(zhì)處于負平衡,抑制細胞惡變。但當(dāng)自噬作用不能修復(fù)這種細胞內(nèi)異常時,不良因素進一步累積,最終導(dǎo)致細胞癌變。3、順鉑是子宮內(nèi)膜癌化療的一線藥物,進一步了解順鉑作用于子宮內(nèi)膜癌細胞后與自噬的關(guān)系具有重大意義。順鉑(cisplatin, CP)是一種含鉑類化療藥物,在臨床應(yīng)用極為廣泛,為非細胞周期依賴性化療藥物,其在晚期及復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜癌的化療中具有重要的地位。因此,進一步了解順鉑作用在子宮內(nèi)膜癌化療中的細胞毒性的機制非常必要。在不同組織和細胞的研究中,順鉑引起的細胞自噬功能各異。順鉑在肝癌細胞Huh-7和HepG2中通過下調(diào)miR-199a-5p進而激活A(yù)tg7增強自噬,并研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞通過自噬誘導(dǎo)癌細胞耐藥。然而,在喉癌細胞Hep-2的研究中,使用3-MA或敲除Beclin-1抑制自噬,能夠增強順鉑引起的細胞凋亡。自噬在腫.瘤治療中的作用非常復(fù)雜,在不同的腫瘤不同的藥物中的作用以及機制都可能不同,因此了解順鉑作用于子宮內(nèi)膜癌細胞后與自噬的關(guān)系,自噬處與何種地位及其作用機制如何至關(guān)重要。4、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展及不良預(yù)后與PI3K/Akt/mTOR信號通路的過度激活密切相關(guān)。PI3K/Akt通路的下游分子是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)。mTOR是一種保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶,是調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、存活和自噬等的匯合點。mTOR信號通路是細胞分裂和合成代謝的調(diào)節(jié)中心,與蛋白合成、細胞周期的調(diào)控相關(guān),為細胞啟動翻譯信號及細胞由Go/G1期進入S期所必需。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活均與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān)。PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活與子宮內(nèi)膜癌中基因的改變對腫瘤的進展也有密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)P13K的催化活性增強,進而激活PI3K/Akt通路,最終促進細胞的癌變。子宮內(nèi)膜癌中PI3K/Akt/mTOR信號通路的過度表達,最終促進細胞繼續(xù)發(fā)生癌變。研究目的自噬作為細胞程序性死亡,為目前腫瘤治療的新靶點,目前仍然有很多分子機制仍有待于進一步闡明。本研究分析順鉑對子宮內(nèi)膜癌是否能引起自噬,并揭示相關(guān)發(fā)生機制,為順鉑在子宮內(nèi)膜癌治療作用中進一步完善自噬機制關(guān)系理論提供實驗依據(jù)。方法體外培養(yǎng)Ishikawa細胞,用不同濃度和不同時間順鉑處理ishihawa細胞,MTS檢測細胞活力,濃度梯度為10μ g/mL、20μ g/mL、40 μ g/mL、80μg/mL,每個濃度設(shè)為0 h、12 h、24 h、48 h、72h五個時間點。選出IC50劑量并確定下一步順鉑組的藥物濃度及作用時間。根據(jù)MTS結(jié)果,選取20μ g/ml,作用時間為0h、12 h、24 h,利用透射電鏡觀察自噬泡形成,并通過熒光顯微鏡觀察微管相關(guān)蛋白1輕鏈3融合蛋白(GFP-LC3)的熒光聚集情況檢測順鉑能否誘導(dǎo)Ishikawa子宮內(nèi)膜癌細胞發(fā)生自噬；應(yīng)用Westerblot檢測mTOR通路中的PI3K、AKT及nTOR蛋白的累積。為了進一步明確mTOR通路在順鉑對子宮內(nèi)膜癌自噬中的作用,應(yīng)用胰島素樣生長因子-1(PI3K激動劑,100ng/ml)與順鉑(20 μ g/mL,24 h)共培養(yǎng),利用透射電鏡觀察自噬泡形成,熒光顯微鏡觀察微管相關(guān)蛋白1輕鏈3融合蛋白(GFP-LC3)的熒光聚集情況再次檢測細胞自噬情況。統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以平均數(shù)加標準差(means±SD)或平均數(shù)加標準誤(means±SEM)表示,應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,通過方差分析和配對t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果順鉑對Ishikawa細胞增殖的影響MTS結(jié)果顯示,Ishikawa細胞對順鉑作用敏感,10μg/mL順鉑作用24小時后,對Ishikawa細胞的增殖有抑制作用,10μg/mL處理12小時、24小時、48小時和72小時后,增殖抑制率分別為18.27±2.25,24.88±3.58,38.27±5.34,45.43±4.25。隨著時間及濃度的增加,細胞增殖的抑制作用明顯增加(P0.01)。20μg/ml順鉑處理組,細胞增殖抑制率在所有時間點均小于50%。40μg/ml和80μg/ml順鉑處理組,細胞增殖抑制率在所有時間點均大于50%。根據(jù)MTS檢測結(jié)果,20μg/ml順鉑處理0小時、12小時和24小時被選作為下面實驗的濃度和時間點。順鉑對Ishikawa細胞自噬的影響應(yīng)用透射電鏡觀察20μg/ml順鉑處理0小時、12小時和24小時處理后的ishihawa細胞中自噬體形成情況。20μg/ml順鉑處理ishihawa細胞培養(yǎng)12小時后,細胞內(nèi)出現(xiàn)雙層膜組成的自噬體。20μg/ml順鉑處理ishihawa細胞培養(yǎng)24小時后,細胞內(nèi)空泡明顯,自噬體聚集。與對照組相比,20μg/ml順鉑培養(yǎng)12小時組的細胞內(nèi)自噬體增加；20μg/ml順鉑培養(yǎng)24小時組較12小時組的細胞內(nèi)自噬體增加；應(yīng)用免疫熒光共聚焦檢測自噬相關(guān)蛋白LC3的表達,結(jié)果顯示,20μg/ml順鉑培養(yǎng)24小時組較12小時組的LC3表達增加,20μg/ml順鉑培養(yǎng)12小時組LC3表達高于對照組。因此,順鉑對子宮內(nèi)膜癌細胞具有促進自噬的作用,并呈時間劑量依賴型。順鉑對mTOR信號通路的抑制作用為了檢測順鉑促進ishihawa細胞自噬的作用機制,western blot檢測PI3Kp85,磷酸化AKT1,總AKT1,磷酸化mTOR;和總mTOR蛋白的表達。結(jié)果顯示,20ug/ml順鉑處理24小時后較12小時組,磷酸化AKT1、磷酸化mTOR及PI3Kp85表達水平明顯下降；20ug/ml順鉑處理12小時組與對照組比較,上述蛋白也明顯下降。但總AKT1及mTOR表達水平未見明顯變化。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)與順鉑共培養(yǎng)逆轉(zhuǎn)順鉑對子宮內(nèi)膜癌細胞自噬的作用為進一步驗證順鉑引起ishihawa細胞自噬是通過抑制mTOR信號通路,設(shè)立三個組,對照組,順鉑組(20ug/ml,24小時)及共培養(yǎng)組(IGF-1100ng/ml與順鉑20ug/m1,24小時),透射電鏡檢測自噬小體,Western blot檢測LC3蛋白表達情況。結(jié)果顯示,應(yīng)用IGF-1激活PI3K/Akt/mTOR信號通路的共培養(yǎng)組透射電鏡檢測自噬小體及LC3蛋白表達均少于順鉑組,但高于對照組。結(jié)論1、10μ g/mL,24小時順鉑對子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖有抑制作用,呈時間劑量依賴型；2、順鉑對子宮內(nèi)膜癌細胞具有促進細胞自噬的作用；呈時間依賴型；是順鉑的抗腫瘤性作用機制之一3、順鉑通過對mTOR信號通路的抑制作用,從而促進子宮內(nèi)膜癌細胞發(fā)生自噬,是順鉑誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細胞發(fā)生的作用機制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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本文編號：2013367