本文選題：宮頸上皮內(nèi)瘤變 + 宮頸癌��； 參考：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一,全球每年約有50萬的新發(fā)例,其中90%以上發(fā)生在發(fā)展中國家。我國每年新發(fā)病例占世界總數(shù)的近1/3。宮頸癌是嚴(yán)重危害我國女性健康的疾病,是值得研究的重大疾病。研究發(fā)現(xiàn)宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)是宮頸癌前期病變,其既可以進展為癌,也可以自然消退。高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生以及CIN進展為宮頸癌的重要因素,但只有大約1%的HR HPV感染者最終發(fā)展為宮頸癌,并且從CIN到宮頸癌大約還需要8-10年之久,由此提示除了HR HPV這個主要的因素外,可能還有其他因素在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起到了協(xié)同作用。因此,探尋這些協(xié)同因素對于闡明宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及宮頸癌的預(yù)防均具有重要的意義,有利于宮頸癌發(fā)病機制的研究,有利于宮頸癌的人群預(yù)防。有文獻報道在HR-HPV(尤其是HPV-16)感染的婦女中補充葉酸有可能減低宮頸上皮內(nèi)瘤變2級(CIN2)及以上病變發(fā)生的風(fēng)險。miRNA可調(diào)控細胞增殖、凋亡、分化、代謝、癌變及自噬。課題組前期通過選擇葉酸含量缺乏與不缺乏的宮頸上皮內(nèi)瘤變及癌組織進行miRNA芯片篩查,篩選出與葉酸含量及宮頸病變級別相關(guān)的差異表達的miRNA,其中miR-224的表達差異顯著。miR-224作為micro-RNAs家族的一員,參與腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。miR-224在某些腫瘤中高表達,如肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等;在某些腫瘤中低表達,如前列腺癌和卵巢癌。在不同的癌癥中miR-224通過作用于不同的靶基因促進或抑制腫瘤細胞的浸潤或轉(zhuǎn)移。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-224可通過Smad4抑制B型病毒性相關(guān)肝癌細胞自噬,有實驗證明在正常組織中長期慢性地抑制細胞自噬,激活腫瘤生成過程,細胞自噬的抑制可能會加重壞死細胞的局部炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致腫瘤的生長。與此同時,細胞自噬也扮演了一個對抗腫瘤生成的角色,細胞自噬可能與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin1是啟動自噬的關(guān)鍵蛋白,是第一個被證實的與細胞自噬活化直接相關(guān)的腫瘤抑制基因,Beclin1缺失易引起腫瘤。LC3是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一定位于自噬泡內(nèi)膜,參與多種信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)的蛋白,是細胞自噬發(fā)生的良好的標(biāo)志物。有報道顯示葉酸缺乏條件下培養(yǎng)的小鼠胚胎干細胞可發(fā)生自噬,自噬相關(guān)基因表達上調(diào),從而促進了自噬的發(fā)生。但葉酸缺乏情況下miR-224對宮頸癌細胞自噬的影響及機制尚未見報道。本項目擬對葉酸缺乏條件下miR-224對宮頸癌細胞自噬的影響及機制進行研究,以細胞自噬為切入點,旨在探索葉酸缺乏與宮頸癌細胞自噬的關(guān)系,為宮頸癌的發(fā)生機制研究提供參考,有望為宮頸癌的預(yù)防提供部分依據(jù)。第一部分山西省介休地區(qū)宮頸上皮內(nèi)瘤變危險因素的研究目的:探討山西省介休地區(qū)婦女宮頸上皮內(nèi)瘤變的相關(guān)危險因素,為宮頸癌的預(yù)防提供人群依據(jù)。方法:于2014年6月~2014年11月間,對山西省介休地區(qū)居住一年以上的已婚、18歲至小于等于65歲符合標(biāo)準(zhǔn)的20000名現(xiàn)場人群,行宮頸上皮內(nèi)瘤變相關(guān)危險因素問卷調(diào)查和宮頸細胞學(xué)檢查,對細胞學(xué)檢查結(jié)果為意義不明確的非典型鱗狀細胞(atypical squamous cells of undeterminedsignificance,ASC-US)及其他異常者,行陰道鏡檢查及組織病理學(xué)檢查,將檢出的宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)者作為病例組,包括CIN1組和CIN2/3組,細胞學(xué)結(jié)果異常但病理組織學(xué)檢查正常,并自愿進入后續(xù)研究者作為對照組。對進入后續(xù)研究隊列的研究對象進一步進行膳食葉酸攝入調(diào)查、陰道微生態(tài)檢測和人乳頭瘤病毒檢測(human papillomavirus,HPV)。采用有序Logistic回歸分析方法,分析CIN發(fā)生相關(guān)的危險因素。(1)宮頸細胞學(xué)及病理學(xué)檢查結(jié)果:通過細胞學(xué)檢測,在20000例中檢出ASC-US及其他異常者1438例(包括宮頸腺細胞異常者),占7.19%,其中ASC-US1270例、不能排除高度鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀上皮細胞(atypical squamous cells,cannot excludehigh grade squamous intraepithelial lesion,ASC-H)7例、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepitheliallesion,LSIL)125例、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)32例、非典型腺體細胞(atypical glandular cells,AGC)2例和宮頸鱗狀細胞癌(squamous of cervical carcinoma,SCC)2例。病檢結(jié)果為CIN和SCC者共421例,總檢出率為421/20000(2.05%;95%CI,1.85 2.25);其中CIN1共317例(1.58%;95%CI,1.41 1.76),CIN2/3共93例(0.50%;95%CI,0.37 0.56)和SCC 11例(95%CI,27 99);檢出CIN2及以上病例共104例(0.52%;95%CI,0.42 0.62)。最終,進入后續(xù)研究隊列者1036例。(2)HPV檢測結(jié)果:1036例中檢測出高危型人乳頭瘤病毒(High-risk human papilloma virus,HR-HPV)陽性293例,總陽性率為28.28%;CIN 1組HR-HPV陽性率為25.87%、CIN2/3組HR-HPV陽性率為76.34%,對照組陽性率22.36%,陽性率在各組之間相比較具有顯著性差異(P0.001);HR-HPV陽性率隨CIN病變程度加重呈趨勢性增高(P0.001);前三位感染型別是16、58和51型。(3)陰道微生態(tài)檢測結(jié)果:CIN 1、CIN2/3組與對照組間滴蟲性陰道炎、外陰陰道假絲酵母菌病、細菌性陰道病及其他類型陰道炎檢出率比較無顯著性差異(P=0.079)。(4)膳食葉酸攝入調(diào)查結(jié)果:病例組平均每日經(jīng)膳食葉酸攝入量為344.61±153.07ug,與對照組(371.50±166.58ug)相比有顯著性差異(P0.001)。(5)宮頸上皮內(nèi)瘤變危險因素分析結(jié)果:(1)經(jīng)單因素分析,危險因素包括:年齡、文化程度、本人職業(yè)、丈夫職業(yè)、性生活后是否清洗外陰、是否采用絕育手術(shù)避孕、絕育術(shù)年限、HPV感染、HR-HPV感染及平均每日經(jīng)膳食攝入葉酸量。(2)將上述因素進行多因素分析,結(jié)果顯示宮頸上皮內(nèi)瘤變的危險因素包括:高危型HPV感染、年齡56-65歲、丈夫職業(yè)為農(nóng)民、性生活后不清洗外陰、平均每日經(jīng)膳食葉酸攝入量較少。結(jié)果:結(jié)論:(1)山西省介休地區(qū)CIN及SCC檢出率較高;(2)CIN的主要危險因素洗外陰及經(jīng)膳食葉酸攝入量較少。包括高危型人乳頭瘤病毒感染、年齡56-65歲、丈夫職業(yè)為農(nóng)民、性生活后不清第二部分miR-224調(diào)控Smad4對宮頸癌細胞生物學(xué)功能影響及機制研究目的:探討miR-224對Smad4的影響,進一步明確miR-224能否通過調(diào)控Smad4對宮頸癌細胞生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。方法:通過預(yù)測靶基因的網(wǎng)站預(yù)測miR-224的靶基因。使用實時熒光定量q RT-PCR法檢測miR-224和Smad4表達量。為了明確miR-224在宮頸癌靶向Smad4,在宮頸癌細胞株Si Ha和He La中,利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達或沉默miR-224,采用實時熒光定量PCR法定量檢測miR-224轉(zhuǎn)染效果進行驗證。在miR-224過表達或沉默的Si Ha和He La細胞中,采用CCK-8法、流式細胞檢測法、細胞劃痕實驗對細胞增殖、凋亡、遷移的生物學(xué)行為進行檢測。在miR-224過表達或沉默的Si Ha和He La細胞中,采用實時熒光定量PCR法及westen blot法對Smad4從m RNA水平和蛋白進行檢測,進而研究miR-224通過調(diào)控Smad4對宮頸癌細胞生物學(xué)功能的影響及作用機制。結(jié)果:通過生物信息學(xué)靶基因預(yù)測網(wǎng)站Smad4被預(yù)測為miR-224的一個靶基因,miR-224可以與Smad4的m RNA3′UTR高度結(jié)合。在宮頸癌細胞株Si Ha和He La中,與正常細胞相比,宮頸癌細胞中miR-224的定量檢測結(jié)果顯示其高表達,Smad4的m RNA低表達。給予miR-224過表達和沉默建立轉(zhuǎn)染細胞模型。在Si Ha和He La中成功轉(zhuǎn)染miR-224 mimic和miR-224 inhibitor后,過表達miR-224可促進Si Ha和He La細胞增殖、遷移,抑制細胞凋亡;而沉默miR-224抑制Si Ha和He La細胞增殖、細胞遷移,促進細胞凋亡。miR-224與Smad4的檢測結(jié)果顯示:在miR-224 mimic轉(zhuǎn)染的Si Ha和He La細胞中,miR-224表達明顯升高,Smad4蛋白表達明顯下降;而在miR-224 inhibitor轉(zhuǎn)染的Si Ha和He La細胞中,miR-224表達降低,Smad4表達升高。結(jié)論:在宮頸癌Si Ha和He La細胞中,miR-224過表達可促進細胞增殖和遷移、抑制細胞凋亡;而沉默miR-224可抑制細胞增殖和遷移、促進細胞凋亡。過表達miR-224可下調(diào)Smad4的表達,沉默miR-224可上調(diào)Smad4的表達。第三部分葉酸及miR-224調(diào)控Smad4影響宮頸癌細胞自噬的初步研究目的:探討葉酸及miR-224對宮頸癌細胞自噬的影響,并對miR-224調(diào)控Smad4對于自噬的影響進行初步研究。方法:采用實時熒光定量PCR法檢測miR-224及Smad4的m RNA在宮頸組織中的表達,采用western blot法檢測上述組織中的miR-224和Smad4的蛋白的表達。在宮頸癌細胞株Si Ha和He La中,利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達或沉默miR-224,采用實時熒光定量PCR法定量檢測miR-224的表達并對轉(zhuǎn)染效果進行驗證。并且采用實時熒光定量PCR法及western blot檢測miR-224過表達或沉默的Si Ha和He La細胞中自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3和p62及Smad4的m RNA及蛋白的表達情況。進一步采用不同濃度的葉酸溶液干預(yù)上述細胞后,檢測Si Ha和He La細胞中自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3、p62和Smad4及其蛋白的表達情況。在宮頸組織中miR-224和Smad4的m RNA及蛋白均有表達。與正常細胞相比,Si Ha和He La細胞的定量檢測結(jié)果顯示miR-224表達顯著增加,Smad4m RNA表達減低。在Si Ha和He La細胞中成功轉(zhuǎn)染miR-224 mimic和miR-224inhibitor后,miR-224 mimic可減少Beclin1、LC3、Smad4表達,而p62表達增加。而在miR-224 inhibitor轉(zhuǎn)染的Si Ha和He La細胞中,Beclin1、LC3、Smad4表達增加,而p62表達減少。采用不同濃度葉酸溶液干預(yù)Si Ha、He La細胞后,結(jié)果顯示在m RNA及蛋白水平,Si Ha和He La細胞中Beclin1、LC3、Smad4表達均增加,p62表達均減少。結(jié)果:結(jié)論:miR-224通過Smad4影響宮頸癌細胞自噬水平。葉酸可影響宮頸癌細胞自噬。
[Abstract]:瀹鐧屾槸濂蟲，

本文編號：1885127