發(fā)布時間：2018-04-30 07:58

  本文選題：外陰陰道假絲酵母菌病 + 菌群結(jié)構(gòu)��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景女性生殖道是人體四大生態(tài)系統(tǒng)中較復(fù)雜的一個生態(tài)系統(tǒng),由陰道解剖結(jié)構(gòu)、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)以及微生態(tài)菌群共同組成。健康女性生殖道內(nèi)存在較多正常的微生物群落,與宿主、環(huán)境之間構(gòu)成相互制約、相互協(xié)調(diào)、動態(tài)平衡的關(guān)系,是宿主抵御致病菌或條件致病菌的重要微生物屏障,與人體健康和疾病的關(guān)系密切。但由于受到環(huán)境變化、藥物刺激、宿主的激素水平和免疫狀態(tài)等因素的影響,女性生殖道內(nèi)的微生態(tài)菌群平衡狀態(tài)被打破而失衡,從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此,全面了解陰道微生態(tài)的菌群組成以及動態(tài)變化,有助于我們了解生殖道感染疾病的發(fā)生、發(fā)展過程,進(jìn)一步指導(dǎo)臨床采取及時的干預(yù)措施,使用適當(dāng)?shù)乃幬镏委?避免濫用藥物治療。由于陰道菌群主要為厭氧茵,培養(yǎng)營養(yǎng)條件要求苛刻,使用傳統(tǒng)培養(yǎng)和分離鑒定的方法很難全面認(rèn)識陰道菌群構(gòu)成,限制了對陰道微生物群落菌群多樣性與疾病關(guān)系的進(jìn)一步研究。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,非培養(yǎng)依賴性技術(shù)的發(fā)明,人們對陰道微生物菌群的認(rèn)識取得了突破性進(jìn)展。微生物的分類鑒定從表型特征鑒定深化為基因特征鑒定。16S rRNA基因聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增是目前最常用的檢測陰道微生物的非培養(yǎng)法。我們通過Illumina Solexa高通量測序平臺測序、結(jié)合帶標(biāo)簽的基于熒光測序平臺的雙末端測序(Barcoded Paired-End Illumina Sequencing, BIPES),可快速、全面了解陰道微生物群落結(jié)構(gòu)信息,外陰陰道假絲酵母菌病((vulvovaginal candidiasis, WC)是由假絲酵母菌引起的一種常見的外陰陰道炎性疾病,約有5%發(fā)展為復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病(Recurrent vulvovaginal candidiasis, RWC)。因其引起瘙癢等癥狀影響婦女的工作和生活,又因其容易反復(fù)發(fā)作經(jīng)久不愈成為臨床研究的一個難點(diǎn)。VVC、RWC的發(fā)病與多種因素有關(guān),發(fā)病機(jī)制仍未明確,目前研究提示與陰道內(nèi)自身微生物菌群的結(jié)構(gòu)及微環(huán)境變化有關(guān)。但假絲酵母菌感染后陰道菌群是否發(fā)生改變,如何改變,目前仍無定論。本研究通過Illumina高通量測序技術(shù)以及BIPES的序列研究方法,比較了解健康育齡女性、VVC和RWC患者的微生物群落結(jié)構(gòu),追蹤健康育齡女性以及VVC患者陰道菌群隨月經(jīng)周期的動態(tài)變化,為進(jìn)一步探討VVC和RWC的病因、治療以及預(yù)防提供理論依據(jù)。研究目的1、通過Illumina高通量測序技術(shù)以及BIPES的序列研究方法,了解健康育齡女性、WC和RWC患者陰道微生物菌群的結(jié)構(gòu),分析陰道菌群的多樣性改變,了解VVC和RWC患者在發(fā)作時期陰道菌群與健康育齡女性的差異。2、追蹤健康育齡女性、VVC患者在月經(jīng)周期變化中的陰道菌群結(jié)構(gòu)信息,探討其菌群結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的模式及與月經(jīng)周期的關(guān)系。方法1,實(shí)驗(yàn)對象：實(shí)驗(yàn)一：選取2013年4月～2013年10月就診于佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院婦科門診的患者12例,平均年齡(28.83±6.10)歲。VVC組5例,納入標(biāo)準(zhǔn)：①癥狀：外陰瘙癢、灼痛,伴有尿痛以及性交痛等癥狀：陰道分泌物增多。②體征：外陰潮紅、水腫,可見抓痕,甚至皸裂,小陰唇內(nèi)側(cè)及陰道粘膜附著白色膜狀物,陰道內(nèi)較多的白色分泌物,呈凝乳狀或豆腐渣樣。③實(shí)驗(yàn)室檢查：陰道分泌物鏡檢找到假絲酵母菌的芽孢或菌絲,或培養(yǎng)有白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等生長。RVVC組5例,納入標(biāo)準(zhǔn)：①1年中發(fā)作WC_4次。②實(shí)驗(yàn)室檢查：陰道分泌物鏡檢找到假絲酵母菌的芽孢或菌絲,或培養(yǎng)有白假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌等生長。健康組(Healthy)2例,納入標(biāo)準(zhǔn)：①無臨床癥狀。②陰道清潔度為Ⅰ～Ⅱ級。③實(shí)驗(yàn)室檢查：陰道分泌物鏡檢未找到假絲酵母菌的芽孢或菌絲。實(shí)驗(yàn)二：2013年6月～2013年9月就診于佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院婦科門診體檢的健康女性2名,平均年齡(27.00±3.00)歲,納入健康組(Healthy).納入標(biāo)準(zhǔn)：①～③同實(shí)驗(yàn)一；④月經(jīng)正常。WC組3例,平均年齡(29.00±4.16)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①～③同實(shí)驗(yàn)一；④月經(jīng)正常。以上各組均為我國漢族人,排除標(biāo)準(zhǔn)：研究對象1個月內(nèi)無全身應(yīng)用抗生素及陰道局部用藥史,3天內(nèi)無性生活史以及陰道灌洗;排除妊娠期、哺乳期；排除全身系統(tǒng)性疾病如：糖尿病、激素治療性疾病(如急慢性腎炎)等；排除滴蟲性、細(xì)菌性陰道病或需氧型陰道炎等。另外實(shí)驗(yàn)二還需滿足以下條件：目前均只有一個性伴侶,采用避孕套避孕或自然避孕法,無口服避孕藥物。2.取樣：實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)二各組研究對象知情同意后,用無菌陰道棉拭子于陰道壁中上段取陰道分泌物,標(biāo)本送檢。實(shí)驗(yàn)二研究對象的取樣時間是月經(jīng)周期中的第2、4、7、14、16、21、27天。3.所有標(biāo)本采用DNA提取試劑盒(深圳易瑞)提取樣本總DNA,具體操作步驟參照說明書。4.16srRNA V4區(qū)基因片段的擴(kuò)增及Illumina測序：以樣本總DNA為模版,采用引物514F和805R,擴(kuò)增其中的16S rRNA V4區(qū)基因。PCR產(chǎn)物以相等的終濃度混合均勻,通過Illumina HiSeq2000平臺進(jìn)行雙末端100bp測序(華大基因,深圳)。5.測得序列經(jīng)過BIPES流程進(jìn)行初步處理。使用TSC進(jìn)行聚類,提取出每個操作分類單元(Operational taxonomy unit, OTU)的代表序列后,利用GAST進(jìn)行物種的分類,其中屬于乳酸菌屬的OTU利用：megablast進(jìn)一步分到種級別,后續(xù)分析包括聚類分析,Alpha多樣性和Beta多樣性分析�；赨nifrac距離,采用QIIME進(jìn)行陰道菌群主分分析。采用linear discriminant analysis (LDA) coupled with effect size measurements(LEfSe)在線工具分析患者特殊的陰道菌群。6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料采用率或構(gòu)成比表示。計(jì)量資料組內(nèi)或組間比較采用方差分析,對多樣性指數(shù)、各菌屬的相對豐度進(jìn)行Wilcoxon秩和檢驗(yàn),P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果實(shí)驗(yàn)一：1.測序數(shù)據(jù)采用BIPES流程進(jìn)行分析,采用UCHIME去除嵌合體序列,本實(shí)驗(yàn)測序樣品數(shù)12個,最終共獲得852992條序列,平均每個樣品71083條。2.根據(jù)QIIME分析流程進(jìn)行beta多樣性分析,展示三組菌群之間的相似度。VVC組菌群Beta多樣性最高,分布廣泛。RVVC組分布緊湊,菌群結(jié)構(gòu)相似度高。健康組Beta多樣性介乎RVVC與VVC之間。3.通過PD whole tree比較三組樣品的Alpha多樣性,分析顯示VVC患者的陰道菌群Alpha多樣性最高,提示其菌群Alpha多樣性較RVVC及健康組明顯增加(T-test,P0.05)。4.在菌屬的水平上,健康組主要以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌,達(dá)95%以上。WC組菌群構(gòu)成呈現(xiàn)多樣化改變,乳桿菌屬豐富度顯著降低,由最多的68%下降至0.2%,加德納菌、普氏菌屬、雙歧桿菌豐富度明顯增加。RVVC組菌群構(gòu)成以惰性乳桿菌為優(yōu)勢菌,約占85%。5.通過LEfSe統(tǒng)計(jì)三組菌屬差異發(fā)現(xiàn),VVC組的放線菌門、雙歧桿菌屬、雙歧桿菌門以及金黃桿菌的豐度較RVVC和健康組明顯增高。而嗜血菌屬在健康組則明顯增高。實(shí)驗(yàn)二：1.測序數(shù)據(jù)采用BIPES流程進(jìn)行分析,采用UCHIME去除嵌合體序列,本實(shí)驗(yàn)測序樣品數(shù)12個,最終共獲得105796條干凈序列,平均每個樣品92610條。2.分別用Chaol、Observed species、PD whole tree、Shannon四個指標(biāo)展示5個研究對象在月經(jīng)周期中陰道菌群的alpha多樣性變化。其中健康組的H2和VVC組的V2的alpha多樣性指數(shù)最低,說明陰道菌屬構(gòu)成相對單一。3.通過計(jì)算歐式距離來展示5個研究對象在月經(jīng)周期中陰道菌群的波動。在月經(jīng)第2天的菌群結(jié)構(gòu)與月經(jīng)第7天明顯拉開距離,提示月經(jīng)第7天陰道菌群明顯有變化,陰道優(yōu)勢菌群迅速生長,菌群的多樣性由復(fù)雜化趨向于單一化。4.在菌屬水平上,隨著月經(jīng)周期變化,健康組主要以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌,VVC組陰道菌群結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜,陰道優(yōu)勢菌群可為惰性乳桿菌(2/3),也可為加德納菌(1/3)。整個月經(jīng)周期陰道菌群處于相互交替的動態(tài)變化中。陰道菌群多樣性增高,則月經(jīng)周期中菌群波動較明顯。5.選取OUT數(shù)量最多的前15位菌屬,通過折線圖可見5個研究對象陰道菌群在月經(jīng)周期中的均有變化。陰道優(yōu)勢菌群的變化顯示有2種模式：一種模式是相互交替變化：自月經(jīng)期后陰道優(yōu)勢菌迅速生長至排卵期前達(dá)高峰,在排卵期(月經(jīng)第14天)開始出現(xiàn)下降,至月經(jīng)期達(dá)最低點(diǎn),其他陰道菌群則相應(yīng)增多；另外一種模式是保持絕對優(yōu)勢的模式。自月經(jīng)期后,陰道優(yōu)勢菌大量生長,一直保持較高的豐富度,至月經(jīng)前期才出現(xiàn)逐漸下降。結(jié)論1.健康育齡女性和RWC患者陰道菌群結(jié)構(gòu)簡單,VVC患者菌群多樣性增高。2.健康女性陰道優(yōu)勢菌群為卷曲乳桿菌,RVVC患者則以惰性乳桿菌為優(yōu)勢菌群。VVC患者陰道菌群的乳桿菌屬比例降低,加德納菌、普氏菌屬、雙歧桿菌等菌屬豐富度增加。3.陰道菌群隨月經(jīng)周期的變化而出現(xiàn)波動,以月經(jīng)前后變化最大。陰道優(yōu)勢菌群變化呈現(xiàn)相互交替變化或保持絕對優(yōu)勢的模式。4.在月經(jīng)周期中健康育齡婦女仍以卷曲乳桿菌為優(yōu)勢菌群,而VVC組中以惰性乳桿菌或其他菌種為優(yōu)勢菌群,菌群多樣性變化增高。5.通過16S rRNA基因以及Illumina測序發(fā)現(xiàn)健康育齡婦女和WC患者在月經(jīng)周期中在陰道內(nèi)一直存在卷曲乳桿菌與惰性乳桿菌,并與多種微生物共存。
[Abstract]:In recent years , with the rapid development of molecular biology and the development of non - culture - dependent techniques , it is difficult to fully understand the composition of vaginal flora and to prevent the use of drug therapy . In this study , the structure of vaginal flora in female , VVC and RWC patients with healthy reproductive age was studied by Illumina high - throughput sequencing technique and sequence research method of BIPES . 2 cases of healthy women ( 27.00 鹵 3.00 ) years of age ( 27.00 鹵 3.00 ) were included in the health group ( Healthy ) .
The average age ( 29.00 鹵 4.16 ) years of normal menstruation in WC group was normal . The standard was 鈶，

本文編號：1823736