本文選題：miR-200c + FUT4�。� 參考：《大連醫(yī)科大學》2017年碩士論文

【摘要】：背景與目的:1.蛋白質(zhì)巖藻糖基化在子宮內(nèi)膜對胚胎的接受能力方面發(fā)揮重要作用。2.巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ(FUT4)在哺乳動物子宮內(nèi)膜上皮細胞中呈階段特異性表達,因此被作為評價子宮內(nèi)膜接受態(tài)的一個重要指標。3.micro RNAs是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,miR-200c是miR-200家族的成員之一,在人類生殖過程中發(fā)揮作用。但是,miR-200c與FUT4的關(guān)系以及其在子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立過程中的作用未見報道。4.本研究旨在探討miR-200c對子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立、胚胎著床的影響及其作用機制,闡述miR-200c對哺乳動物胚胎著床過程的調(diào)控作用。方法:1.通過Real-time PCR,Western blot,ELISA檢測正常未孕、不孕癥、正常早孕、流產(chǎn)患者血清中miR-200c、FUT4的表達。2.CCK8、平板克隆形成實驗和細胞體外黏附實驗檢測miR-200c對細胞增殖及接受胚胎能力的影響。3.雙熒光素酶基因報告實驗驗證FUT4是否是miR-200c的靶基因。4.通過Wnt/β-catenin信號通路進一步研究miR-200c對胚胎著床的調(diào)控作用。結(jié)果:1.PCR、ELISA和Western blot方法檢測結(jié)果顯示:不孕癥患者血清中miR-200c的表達比正常未孕女性高,流產(chǎn)患者血清中miR-200c的含量比正常早孕女性血清中高,具有顯著性差異(*p0.05;***p0.001)。不孕癥患者血清中FUT4的表達比正常未孕女性低,流產(chǎn)患者血清中FUT4的含量比正常早孕女性血清中低,具有顯著型差異(**p0.01;***p0.001)2.miR-200c抑制細胞增殖和胚胎黏附功能。CCK-8實驗連續(xù)5天記錄細胞的生長情況。轉(zhuǎn)染miR-200c mimics細胞組的生長速度顯著慢于對照組細胞,而轉(zhuǎn)染Anti-miR-200c后,細胞的增殖能力顯著高于對照組。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示,miR-200c mimics轉(zhuǎn)染組細胞的克隆形成數(shù)低于對照組,而轉(zhuǎn)染Anti-m R-200c細胞組細胞的克隆形成數(shù)顯著高于對照組,差異存在統(tǒng)計學意義(**p0.01;***p0.001)。細胞體外黏附實驗結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-200c mimics細胞組的黏附能力顯著低于對照組,轉(zhuǎn)染Anti-miR-200c細胞組的黏附能力顯著高于對照組,差異存在統(tǒng)計學意義(*p0.05)。3.FUT4是miR-200c的靶基因。通過軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-200c與FUT4存在結(jié)合位點,因此我們構(gòu)建了相應熒光素酶載體,同時構(gòu)建了相應的突變型載體,與miR-200c mimics共同轉(zhuǎn)染進入RL-95細胞中。轉(zhuǎn)染miR-200c mimics與熒光素酶載體的RL95-2細胞中,FUT4的熒光素酶活性低于對照組(*p0.05);轉(zhuǎn)染miR-200c mimics與熒光素酶載體的RL95-2細胞中FUT4的熒光素酶活性與轉(zhuǎn)染突變型載體組FUT4的熒光素酶活性不存在統(tǒng)計學差異。Western blot結(jié)果顯示miR-200c mimics轉(zhuǎn)染后可顯著下調(diào)FUT4的表達,當與FUT4 c DNA共轉(zhuǎn)染后,又可以回調(diào)FUT4的表達。Anti-miR-200c轉(zhuǎn)染后可顯著上調(diào)FUT4的表達,當與FUT4 si RNA共轉(zhuǎn)染后可回調(diào)FUT4的表達。細胞免疫熒光染色得到了相同的結(jié)果,miR-200c可下調(diào)FUT4的表達。4.miR-200c通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活影響子宮內(nèi)膜細胞的功能。轉(zhuǎn)染miR-200c可抑制p-GSK3β、β-catenin的表達,其結(jié)果與使用Wnt/β-catenin通路抑制劑DKK的效果一致,當與FUT4 c DNA共轉(zhuǎn)染后可重新激活p-GSK3β、β-catenin的表達。當Anti-miR-200c抑制miR-200c的表達后可激活p-GSK3β、β-catenin的表達,與FUT4 si RNA共轉(zhuǎn)染后可重新抑制p-GSK3β、β-catenin的表達。結(jié)論:1.miR-200c可由血清檢測,其表達量與FUT4呈負相關(guān)。2.抑制miR-200c表達可改善人內(nèi)膜細胞RL95-2和胚胎細胞JAR之間的黏附。3.miR-200c對FUT4具有靶向調(diào)控作用。4.miR-200c通過靶向FUT4,抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活,抑制子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立。
[Abstract]:Background and purpose: 1. protein fucoylation plays an important role in the acceptance of the endometrium in the endometrium..2. fucoidase IV (FUT4) is a stage specific expression in the epithelial cells of mammalian endometrium, so it is an important indicator of the acceptance of endometrium,.3.micro RNAs is a kind of endogenous The non coding small molecule RNA, miR-200c, is one of the members of the miR-200 family and plays a role in the human reproduction process. However, the relationship between miR-200c and FUT4 and its role in the establishment of endometrial receptivity has not been reported. The purpose of.4. study is to explore the establishment of miR-200c in endometrium acceptance, the effect of embryo implantation and its work. The mechanism was used to explain the regulation of miR-200c on the implantation process of mammalian embryos. Methods: 1. Real-time PCR, Western blot, ELISA were used to detect normal unpregnancy, infertility, normal early pregnancy, the expression of miR-200c, FUT4 in the serum of abortion patients, the experiment of flat clones and the adhesion test of cells in vitro to detect the proliferation and connection of the cells by miR-200c. The effect of.3. double luciferase gene report test on the effect of embryo ability on whether FUT4 is the target gene of miR-200c,.4. can further study the regulation of miR-200c on embryo implantation through the Wnt/ beta -catenin signaling pathway. Results: 1.PCR, ELISA and Western blot method detection results show that the expression of miR-200c in the serum of the patients with infertility is more than normal The content of miR-200c in the serum of abortion patients is higher than that of normal pregnant women (*p0.05; ***p0.001). The expression of FUT4 in serum of infertility patients is lower than that of normal unpregnant women. The content of FUT4 in the serum of abortion patients is lower than that of normal early pregnant women, and there is a significant difference (**p0.01; ***p0.001) 2.mi. The growth of R-200c cells was recorded for 5 days for 5 days. The growth rate of the transfected miR-200c mimics cell group was significantly slower than that of the control group. After transfection of Anti-miR-200c, the proliferation ability of the cells was significantly higher than that of the control group. The results of the cell clone formation experiment showed that the miR-200c mimics transfection group was found. The number of cell clones was lower than that of the control group, and the number of cloned cells in the transfected Anti-m R-200c cell group was significantly higher than that of the control group, the difference was statistically significant (**p0.01; ***p0.001). The adhesion energy of the cells in vitro in vitro showed that the adhesion energy of the transfected miR-200c mimics cell group was significantly lower than that of the control group, and the transfection of the Anti-miR-200c cell group was significantly lower than that of the control group. The adhesion ability was significantly higher than that of the control group. The difference was statistically significant (*p0.05).3.FUT4 was the target gene of miR-200c. The binding site of miR-200c and FUT4 was found by software prediction. Therefore, we constructed the corresponding luciferase carrier, and constructed the corresponding mutant vector and transfected into RL-95 cells with miR-200c mimics. In RL95-2 cells infected with miR-200c mimics and luciferase carrier, the luciferase activity of FUT4 was lower than that of the control group (*p0.05), and the luciferase activity of FUT4 in RL95-2 cells transfected with miR-200c mimics and luciferase carrier was not statistically different from the luciferase activity of the mutant carrier group FUT4, and the.Western blot results showed that the activity of the luciferase activity of the FUT4 transfected with the mutant carrier group was not statistically significant. After transfection of 0C mimics, the expression of FUT4 was significantly downregulated. When transfected with FUT4 C DNA, the expression of FUT4 could be regulated by.Anti-miR-200c transfection, and the expression of FUT4 could be up to be up. The same result was obtained when the FUT4 Si RNA was co transfected. Inhibition of the activation of Wnt/ beta -catenin signaling pathway affects the function of endometrial cells. Transfection of miR-200c can inhibit the expression of p-GSK3 beta, beta -catenin, and the result is consistent with the effect of Wnt/ beta -catenin pathway inhibitor DKK. When the FUT4 C DNA co transfection is co transfected, it can reactivate the p-GSK3 beta, beta expression. The expression of 0C can activate the expression of p-GSK3 beta, beta -catenin and repress the expression of p-GSK3 beta and beta -catenin after CO transfection with FUT4 Si RNA. Conclusion: 1.miR-200c can be detected by serum, and its expression is negatively correlated with FUT4 and.2. inhibition miR-200c expression can be modified between human endometrium cells and embryonic cells. Targeting.4.miR-200c regulates the activation of Wnt/ beta -catenin signaling pathway by targeting FUT4, and inhibits the establishment of endometrial receptivity.

【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714.8

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本文編號：1815118