發(fā)布時(shí)間：2018-04-27 05:42

  本文選題：卵巢癌 + 多藥耐藥��； 參考：《吉林大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：上皮型卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是惡性程度極高的婦科腫瘤。據(jù)估計(jì)，2011年在美國(guó)有21990新發(fā)病例，并且有15460例死亡。鉑/紫杉醇為基礎(chǔ)的化療是EOC分期手術(shù)和切除術(shù)后的現(xiàn)行治療標(biāo)準(zhǔn)。盡管化療在EOC的治療上取得一定的成效，但其預(yù)后很差，存在腹部或盆腔復(fù)發(fā)現(xiàn)象，并可進(jìn)一步發(fā)展耐藥性。而耐藥性的產(chǎn)生，是導(dǎo)致卵巢癌死亡率居高不下的重要原因。因此，如何提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，是當(dāng)前臨床治療EOC亟待解決的問題之一。 腫瘤細(xì)胞通常涉及到多基因和多通路的激活，從而獲得對(duì)化療和放療誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抵抗能力。已知的幾種細(xì)胞死亡方式包括壞死、凋亡和自噬性細(xì)胞死亡等。細(xì)胞凋亡又稱Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡，是指生物體為維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在特定信號(hào)誘導(dǎo)下，由多個(gè)基因調(diào)控的細(xì)胞自主地進(jìn)行程序性死亡的過程，是放射治療和其他癌癥治療方式的最重要的死亡機(jī)制。自噬性細(xì)胞死亡是除凋亡外的另一重要的細(xì)胞死亡調(diào)控機(jī)制，在癌癥的發(fā)展中扮演重要的角色。細(xì)胞自噬是一種進(jìn)化上保守的代謝過程，其主要作用是將細(xì)胞內(nèi)功能受損的蛋白質(zhì)以及多余的或有缺陷的細(xì)胞器降解，并對(duì)蛋白質(zhì)和氨基酸等回收和再利用。除了這個(gè)關(guān)鍵作用，還發(fā)現(xiàn)自噬在其他方面也有重要的職能，特別是在有應(yīng)激壓力或損傷的情況下會(huì)導(dǎo)致自噬顯著增強(qiáng)。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥中發(fā)揮著重要的作用，并且依據(jù)腫瘤類型和環(huán)境條件不同而呈現(xiàn)促進(jìn)或抑制兩種相反的調(diào)控結(jié)局，即雙向調(diào)控作用。因此，闡明自噬在腫瘤的治療中發(fā)揮的作用和機(jī)制有利于針對(duì)不同類型的腫瘤，尤其放化療抵抗的腫瘤，采取個(gè)體化的治療方案而能夠獲得良好的治療效果。 目的：以人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3及其耐藥表型SKVCR為研究對(duì)象，探討自噬在化療及電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用及其機(jī)制，為指導(dǎo)臨床腫瘤綜合治療方案的優(yōu)化以及新治療靶點(diǎn)的探索提供理論依據(jù)。 方法：①選用人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3及其多藥耐藥表型細(xì)胞株SKVCR；②應(yīng)用深部X射線治療機(jī)進(jìn)行細(xì)胞照射，照射條件：電壓180kV，電流18.0mA，濾板為0.25mm Cu和1.0mmAl，靶皮距60cm，劑量率0.40Gy· min 1；③藥物選�。篤CR（長(zhǎng)春新堿）、THP（吡柔比星）、VP-16（依托泊苷）；④細(xì)胞存活檢測(cè)采用CCK8（cell counting Kit-8）法和集落形成法；⑤細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)采用Real-Time PCR方法檢測(cè)；⑥蛋白表達(dá)變化采用Western blot檢測(cè)；⑦細(xì)胞自噬采用GFP-LC3轉(zhuǎn)染和MDC染色；⑧細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用Hoechst33342染色檢測(cè)；⑨細(xì)胞凋亡、自噬和細(xì)胞周期采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。 結(jié)果： 1.不同濃度VCR、VP-16、THP能夠明顯抑制SKOV3及SKVCR細(xì)胞的生長(zhǎng)，相同藥物濃度作用后，SKVCR細(xì)胞的存活率顯著高于SKOV3細(xì)胞（P 0.05）。SKVCR中的P-gp蛋白表達(dá)量是SKOV3的50倍以上。MDC熒光染色、Real-time PCR及Western blot方法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞的基礎(chǔ)凋亡水平接近，但耐藥株SKVCR中自噬發(fā)生率明顯高于SKOV3細(xì)胞（P 0.05）。 2.不同濃度VCR作用4、8、24、48h可以明顯抑制SKOV3及SKVCR細(xì)胞存活，且細(xì)胞毒性具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性；選取0.02μg/ml VCR作用SKOV3細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯影響，但細(xì)胞自噬率升高到2.63倍；選取10μg/ml VCR處理SKVCR細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)SKVCR細(xì)胞凋亡的發(fā)生（P 0.05），但對(duì)自噬無明顯影響。 3.分別取3MA、CQ、Rapamycin和ZVAD以最大無作用劑量處理兩種細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3MA和CQ能夠抑制自噬，Rapamycin可以誘導(dǎo)自噬，ZVAD對(duì)Caspase-3活化有明顯抑制作用，并顯著抑制凋亡（P 0.05）。 4. VCR與3MA、CQ、Rapamycin、ZVAD單獨(dú)或聯(lián)合作用SKOV3細(xì)胞24h后發(fā)現(xiàn)：3MA和Rapamycin對(duì)VCR藥物敏感性無影響；CQ與VCR聯(lián)合作用能夠增加低濃度VCR對(duì)SKOV3細(xì)胞的增值抑制率（P 0.05）；ZVAD能夠降低0.02~0.2μg/ml VCR對(duì)SKOV3細(xì)胞的增值抑制作用，細(xì)胞生存率高于VCR單獨(dú)作用組（P 0.05）。MDC染色、流式細(xì)胞術(shù)及Western blot結(jié)果表明，VCR誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞發(fā)生自噬，但對(duì)凋亡無影響，而預(yù)先給予自噬抑制劑3MA和CQ可以降低VCR誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬（P 0.05），同時(shí)增加VCR誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞凋亡，而預(yù)先加入ZVAD能夠抑制VCR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞存活（P 0.05）。 5. VCR與3MA、CQ、Rapamycin、ZVAD單獨(dú)或聯(lián)合作用于SKVCR細(xì)胞24h后，與VCR單獨(dú)作用相比，3MA/CQ與VCR共同作用能明顯降低細(xì)胞生存率，起到化療增敏作用（P 0.05），而Rapamycin則無增敏作用（P0.05）；與VCR單獨(dú)作用相比，ZVAD則提高VCR作用后SKVCR的生存率（P 0.05），降低SKVCR對(duì)VCR的藥物敏感性。流式細(xì)胞術(shù)及Western blot結(jié)果表明，在VCR給藥前加入自噬抑制劑3MA和CQ，能夠降低VCR誘導(dǎo)的SKVCR細(xì)胞自噬（P 0.05），同時(shí)增加VCR誘導(dǎo)的SKVCR細(xì)胞凋亡，而預(yù)先加入ZVAD能夠抑制VCR誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和自噬（P 0.05）。 6.輻射敏感性研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射作用于SKOV3和SKVCR細(xì)胞可以顯著降低細(xì)胞存活率，而且電離輻射對(duì)SKOV3及SKVCR的細(xì)胞毒性具有劑量依賴性，而在單次照射和分割照射之間沒有差異；SKOV3細(xì)胞的輻射敏感性高于其耐藥株（P 0.05）。 7.電離輻射對(duì)細(xì)胞死亡影響的研究發(fā)現(xiàn)，輻射引起SKOV3細(xì)胞核固縮、碎裂、染色增強(qiáng)、濃縮，同時(shí)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實(shí)不同輻射方式可以誘導(dǎo)SKOV3和SKVCR細(xì)胞的凋亡發(fā)生（P 0.05）。電離輻射作用后SKOV3細(xì)胞和SKVCR細(xì)胞MDC陽性百分率及MAPLC3II/I的比值明顯增加（P 0.05），表明電離輻射能夠誘導(dǎo)發(fā)生凋亡和自噬。 8.調(diào)控劑對(duì)輻射敏感性的影響：凋亡抑制劑ZVAD對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的SKOV3和SKVCR細(xì)胞死亡率沒有影響，提示電離輻射誘導(dǎo)SKOV3和SKVCR細(xì)胞死亡可能是非凋亡依賴性的；而自噬抑制劑3MA使SKVCR細(xì)胞生存率顯著下降（P 0.05），顯示輻射增敏作用。 9.調(diào)控劑對(duì)細(xì)胞死亡的影響：應(yīng)用ZVAD后發(fā)現(xiàn)，與電離輻射單獨(dú)作用相比，ZVAD抑制SKOV3和SKVCR細(xì)胞凋亡的同時(shí)伴隨自噬抑制。應(yīng)用3MA后發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)電離輻射組相比，兩種細(xì)胞MDC陽性百分率降低（P 0.05），3MA抑制了電離輻射誘導(dǎo)的自噬；3MA對(duì)電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用不同，3MA抑制了輻射誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞凋亡，卻增加了SKVCR的凋亡率（P 0.05）。 10.電離輻射對(duì)細(xì)胞周期的影響：輻射作用SKOV3和SKVCR細(xì)胞，，可誘導(dǎo)G2/M期阻滯（P 0.05）；在SKVCR細(xì)胞中，S期細(xì)胞占比例較高，而且電離輻射引起S期時(shí)相明顯延遲，但是在3MA作用后，發(fā)現(xiàn)輻射最不敏感的S期細(xì)胞明顯減少，而相對(duì)敏感的G1/M期細(xì)胞比例增加（P 0.05）。表明3MA能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期再分布，協(xié)同影響輻射的殺傷作用。 結(jié)論： 1. SKVCR細(xì)胞中的自噬高表達(dá)現(xiàn)象是產(chǎn)生化療耐藥的重要機(jī)制之一。 2. VCR化療過程中發(fā)現(xiàn)，抑制自噬顯著增加VCR誘導(dǎo)SKVCR細(xì)胞凋亡的能力，增加SKVCR細(xì)胞對(duì)VCR的化療敏感性。 3.電離輻射作用能夠誘導(dǎo)兩種卵巢癌細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，自噬增加SKVCR對(duì)電離輻射的抗性。通過3MA抑制SKVCR細(xì)胞的自噬，可抑制電離輻射誘導(dǎo)S期延遲并增加輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而提高放療敏感性。 自噬抑制劑有望成為耐藥型卵巢癌放化療的增敏劑。
[Abstract]:Epithelial ovarian cancer ( EOC ) is an extremely malignant gynecological tumor . It is estimated that there were 21990 new cases in the United States in 2011 , and 15460 died . The platinum / paclitaxel - based chemotherapy was the current treatment standard after EOC .

Autophagy cell death is one of the most important death mechanisms of radiotherapy and other cancer treatments . It is also found that autophagy plays an important role in the development of cancer .

Objective : To study the role and mechanism of autophagy in the cell death induced by chemotherapy and ionizing radiation in human ovarian cancer cell line SKline and its resistant phenotype SKVCR , and to provide a theoretical basis for guiding the optimization of clinical tumor comprehensive treatment scheme and the exploration of new therapeutic target .

Methods : 鈶

本文編號(hào)：1809467