本文選題：P物質(zhì) + NK-1受體�。� 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生在子宮內(nèi)膜的上皮性惡性腫瘤,以來(lái)源于子宮內(nèi)膜腺體的腺癌最常見(jiàn),2011年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明子宮內(nèi)膜癌已成為全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤,并且隨著人口老齡化、肥胖及激素替代療法的應(yīng)用,其發(fā)病率及死亡率的增加趨勢(shì)更加顯著,但其病因?qū)W機(jī)制尚未完全闡明。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展,源自腫瘤組織的肽類物質(zhì)的表達(dá)及分泌日益引起人們的關(guān)注,P物質(zhì)(Substance P,SP)因其廣泛分布于人體各個(gè)組織而成為研究的熱點(diǎn)。SP是由11個(gè)氨基酸殘基組成的神經(jīng)多肽,由Tac-1基因編碼,屬速激肽家族,其最初是作為神經(jīng)遞質(zhì)及疼痛遞質(zhì)而被人們熟悉,具有多種生物學(xué)活性:參與疼痛的傳遞,引起胃腸道平滑肌收縮,調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng);在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中作為神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)節(jié)遞質(zhì),調(diào)節(jié)情感和行為,阻斷其受體后可起到止痛、止吐、抗抑郁和抗焦慮的作用。近年來(lái),一些研究結(jié)果顯示SP在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中也起到調(diào)節(jié)作用,其在多種腫瘤組織中高表達(dá),能夠增加腫瘤組織中神經(jīng)纖維的數(shù)量,增強(qiáng)腫瘤組織中的信號(hào)傳遞,有助于腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移;其可引起腫瘤細(xì)胞有絲分裂增加、使腫瘤細(xì)胞免于凋亡以及調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移(包括侵襲、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移);其還在腫瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞及癌灶旁血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),可刺激腫瘤血管生成,通過(guò)增加對(duì)腫瘤組織的血供來(lái)促進(jìn)腫瘤增長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。SP受體包括神經(jīng)激肽1(neurokinin 1,NK-1)、神經(jīng)激肽2(neurokinin2,NK-2)及神經(jīng)激肽3(neurokinin 3,NK-3),但SP主要與NK-1結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用。NK-1屬G蛋白偶聯(lián)受體,其與SP結(jié)合后可引起磷酸肌醇水解、鈣離子內(nèi)流及絲裂原激活蛋白激酶被激活,從而促使腫瘤細(xì)胞增殖、分化、血管形成及轉(zhuǎn)移;國(guó)內(nèi)外報(bào)道中提出高選擇性NK-1受體拮抗劑L-733,060可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡,而這些功能主要是依靠抑制SP而發(fā)揮作用。但是目前對(duì)于SP在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)及其與臨床病理特征的關(guān)系尚不清楚,SP以及NK-1受體拮抗劑對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響也尚無(wú)報(bào)道。因此,本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法、real-timepcr、western-blot方法觀察sp在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)情況并分析其與臨床病理特征的關(guān)系,采用mtt、transwell、real-timepcr、western-blot、elisa技術(shù)研究sp及nk-1受體拮抗劑對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌ishikawa細(xì)胞增殖、侵襲以及vegf-c、mmp-9表達(dá)的影響,以闡明p物質(zhì)在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及機(jī)制。第一部分p物質(zhì)在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及意義目的:探討p物質(zhì)在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法:選取2014.1-2014.3在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院術(shù)前未經(jīng)任何治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者15例及同期行子宮全切術(shù)且病理證實(shí)無(wú)子宮內(nèi)膜病變者10例作為研究對(duì)象,采用real-timepcr及western-blot方法比較sp在正常子宮內(nèi)膜及子宮內(nèi)膜腺癌組織中表達(dá)的差異。選取2014.4-2014.12在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院住院手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜腺癌患者56例為實(shí)驗(yàn)組,其中figoⅠ期28例,Ⅱ期7例,Ⅲ期21例;組織學(xué)分級(jí)按照who標(biāo)準(zhǔn):高分化(g1)17例,中分化(g2)21例,低分化(g3)18例;浸潤(rùn)肌層1/234例,≥1/222例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例,無(wú)轉(zhuǎn)移17例;取同期19例行子宮全切術(shù)且病理證實(shí)無(wú)子宮內(nèi)膜病變者為對(duì)照組,采用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)sp的表達(dá),分析sp表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果:1real-timepcr結(jié)果顯示spmrna在子宮內(nèi)膜腺癌組織及正常組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為2.624±0.134、1.015±0.021,兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.001);western-blot結(jié)果顯示sp蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌組織的相對(duì)表達(dá)量為1.062±0.094,明顯高于正常組織中的0.820±0.060(p0.05);2sp表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞的胞質(zhì)及部分胞膜,56例組織標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率為67.86%;其在正常子宮內(nèi)膜細(xì)胞中甚少表達(dá),偶表達(dá)于細(xì)胞的胞質(zhì),陽(yáng)性表達(dá)率為21.05%,兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.001);3sp在子宮內(nèi)膜腺癌不同的組織學(xué)分級(jí)(g1、g2及g3)中陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.94%、71.73%及77.77%,三組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);在肌層浸潤(rùn)深度1/2及≥1/2組中sp陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.51%和72.72%,兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);sp在Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ-Ⅳ期子宮內(nèi)膜腺癌患者中陽(yáng)性表達(dá)率分別為53.57%、71.43%及85.71%,三組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),但組間比較僅Ⅰ期與Ⅲ-Ⅳ期患者有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組sp表達(dá)陽(yáng)性率分別為47.06%和76.92%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:p物質(zhì)在子宮內(nèi)膜腺癌組織中高表達(dá),并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說(shuō)明神經(jīng)內(nèi)分泌機(jī)制參與了子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,為子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的理論依據(jù),而p物質(zhì)也有望成為子宮內(nèi)膜腺癌判斷預(yù)后及隨訪的新指標(biāo)。第二部分p物質(zhì)對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌ishikawa細(xì)胞增殖和侵襲的影響目的:探討p物質(zhì)對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌ishikawa細(xì)胞增殖和侵襲的影響及作用機(jī)制。方法:利用real-timepcr及western-blot的方法檢測(cè)ishikawa細(xì)胞株中sp及其受體nk-1的表達(dá);向ishikawa培養(yǎng)液中加入不同濃度的sp,采用mtt法檢測(cè)sp促細(xì)胞增殖的作用,利用transwell小室檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響;向ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)液中加入nk-1受體拮抗劑l-733,060,再與sp共培養(yǎng),觀察sp促細(xì)胞增殖及侵襲作用的變化。結(jié)果:1子宮內(nèi)膜腺癌ishikawa細(xì)胞及正常組織中spmrna的相對(duì)表達(dá)量分別為3.645±0.275和1.020±0.025;nk-1mrna的相對(duì)表達(dá)量分別為4.238±0.474和1.030±0.042。子宮內(nèi)膜腺癌ishikawa細(xì)胞中sp及nk-1的表達(dá)均明顯高于正常組織(p0.001);2子宮內(nèi)膜腺癌ishikawa細(xì)胞及正常組織中sp蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.198±0.110和0.869±0.067;nk-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.251±0.116和0.919±0.040。子宮內(nèi)膜腺癌ishikawa細(xì)胞中sp及nk-1的表達(dá)均明顯高于正常組織(p0.01);3向ishikawa細(xì)胞中加入sp培養(yǎng)48小時(shí)后,與空白對(duì)照組相比,sp有明顯的促細(xì)胞增殖作用(p0.001);當(dāng)sp在10-9mol/l~10-7mol/l時(shí),隨著sp濃度的增加,細(xì)胞增殖能力逐漸增強(qiáng)(p0.05);但當(dāng)sp增加到10-6mol/l時(shí),細(xì)胞增殖能力有所下降。將不同濃度nk-1受體阻滯劑l-733,060(0,5,10,20and40μmol/l)與ishikawa細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)后再加入10-7mol/lsp培養(yǎng)48h后,與空白對(duì)照組相比,5μmol/l組無(wú)明顯抑增殖作用(p0.05),其他各組細(xì)胞增殖率均隨l-733,060的濃度增加逐漸降低(p0.05),而20μmol/l與40μmol/l組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4在侵襲實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組sp濃度選取10-9mol/l~10-7mol/l,與ishikawa細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)后,各實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞穿過(guò)基底膠的數(shù)量明顯高于空白對(duì)照組(p0.01);選取sp濃度為10-7mol/l及l(fā)-733,060濃度20μmol/l進(jìn)行transwell小室實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示ishikawa細(xì)胞侵襲能力明顯低于10-7mol/lsp組(p0.01)。結(jié)論:p物質(zhì)可明顯促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲,并且nk-1受體拮抗劑可明顯抑制其這一能力,說(shuō)明p物質(zhì)對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌的促增長(zhǎng)作用主要是通過(guò)與nk-1受體結(jié)合而產(chǎn)生的,為子宮內(nèi)膜腺癌的治療提供了新的靶點(diǎn)。第三部分p物質(zhì)對(duì)ishikawa細(xì)胞vegf-c和mmp-9表達(dá)的影響目的:檢測(cè)p物質(zhì)及其受體拮抗劑對(duì)子宮內(nèi)膜腺癌ishikawa細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子c(vascularendothelialgrowthfactorc,vegf-c)及基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrixmetalloproteinase9,mmp-9)表達(dá)的影響,探討p物質(zhì)促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制。方法:向ishikawa培養(yǎng)液中加入不同濃度的sp,利用real-timepcr及western-blot的方法檢測(cè)ishikawa細(xì)胞中vegf-c及mmp-9表達(dá)的變化;采用elisa法檢測(cè)不同組別細(xì)胞培養(yǎng)上清中vegf-c及mmp-9的含量。向ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)液中加入nk-1受體阻滯劑l-733,060,再與sp共培養(yǎng),利用real-time及western-blot檢測(cè)vegf-c及mmp-9的表達(dá);采用elisa法檢測(cè)不同組別細(xì)胞培養(yǎng)上清中vegf-c及mmp-9的含量。結(jié)果:1不同濃度sp(10-9mol/l、10-8mol/l及10-7mol/l)作用于ishikawa細(xì)胞48h后,vegf-cmrna的相對(duì)表達(dá)量分別為2.133±0.133、2.533±0.191、2.9455±0.287;mmp-9mrna的相對(duì)表達(dá)量分別為2.035±0.160、2.450±0.205、3.045±0.258,兩者均明顯高于空白對(duì)照的1.050±0.053和1.020±0.028(p0.001)。10-7mol/lsp+20μmol/ll-733,060組vegf-cmrna及mmp-9mrna的相對(duì)表達(dá)量分別為1.465±0.108和1.483±0.184,均明顯低于10-7mol/L SP組(P0.001)。2空白對(duì)照、10-9mol/L SP、10-8mol/L SP及10-7mol/L SP組VEGF-C蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.953±0.03、1.130±0.365、1.235±0.420、1.343±0.512;MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.913±0.038、1.228±0.046、1.350±0.063、1.553±0.120,各實(shí)驗(yàn)組VEGF-C和MMP-9的表達(dá)均高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10-7mol/L SP+20μmol/L L-733,060組VEGF-C及MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.840±0.036和0.855±0.029,均明顯低于10-7mol/L SP組(P0.01)。3空白對(duì)照和各實(shí)驗(yàn)組(10-9mol/L、10-8mol/L及10-7mol/L)培養(yǎng)上清液中VEGF-C的含量分別為847.813±28.311、1144.897±38.955、1555.823±56.472、2151.397±79.277;MMP-9含量分別為84.683±5.073、125.327±13.701、177.087±23.033、250.567±31.480,各實(shí)驗(yàn)組VEGF-C和MMP-9的含量均高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001);10-7mol/L SP+20μmol/L L-733,060組VEGF-C及MMP-9含量分別為955.933±31.062及96.663±7.02,均明顯低于10-7mol/L SP組(P0.01)。結(jié)論:P物質(zhì)可上調(diào)子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中VEGF-C和MMP-9的表達(dá),而NK-1受體拮抗劑可抑制其這一功能,說(shuō)明SP/NK-1系統(tǒng)可通過(guò)刺激VEGF-C的表達(dá)而促進(jìn)腫瘤淋巴管形成,也可通過(guò)誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)增多而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲,進(jìn)一步闡明了該系統(tǒng)促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為惡性腫瘤尤其是晚期或復(fù)發(fā)患者的生物治療提供了新的途徑。
[Abstract]:In recent years , the expression of neuropeptides derived from 11 amino acid residues has been implicated in the development of tumor tissues , which can stimulate the growth and metastasis of tumor cells . The effects of SP and NK - 1 receptor antagonists on the proliferation , invasion and expression of VEGF - c , mmp - 9 in endometrial adenocarcinoma were investigated by immunohistochemical staining , real - time polymerase chain reaction ( RT - PCR ) and western - blot .

【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1801232