本文選題：子癇前期(PE) + 可溶性血管內(nèi)皮生長受體-1(sFlt-1)　； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：研究背景： 妊娠期高血壓疾病是妊娠期特發(fā)的全身性疾病,據(jù)1988年我國25省流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)發(fā)病率為9.4-10.4%。而子癇前期(preeclampsia, PE)是該疾病的常見類型,PE于妊娠20周以后發(fā)病,以高血壓、水腫、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)。PE不僅影響妊娠結(jié)局,也影響產(chǎn)婦及其后代的遠(yuǎn)期預(yù)后：與正常孕婦相比,PE患者日后發(fā)生心血管及腦血管疾病的幾率增加約2倍,嬰兒日后發(fā)生心臟病的風(fēng)險(xiǎn)也增加5倍。 根據(jù)人民衛(wèi)生出版社最新一版教材中重新提出,PE的治療原則修改為休息、鎮(zhèn)靜、解痙、有指證降壓、利尿,密切監(jiān)測母胎情況,適時終止妊娠。盡管治療方案的一再完善,但臨床工作中發(fā)現(xiàn),PE病情變化復(fù)雜、難以預(yù)測、不良妊娠結(jié)局時有發(fā)生；導(dǎo)致治療效果欠佳的主要原因在于其發(fā)病機(jī)制尚未闡明,而現(xiàn)有的學(xué)說理論均未能對PE的發(fā)病作出完整的詮釋并對其治療進(jìn)行有效指導(dǎo)。因此,探討PE發(fā)生機(jī)制不僅是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界面臨的挑戰(zhàn),也是保護(hù)我國有限醫(yī)療資源,關(guān)乎社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要課題。 近年來,研究表明可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1(sFlt-1)在妊娠過程中通過阻斷血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)作用而參與PE的發(fā)病。sFlt-1是VEGF受體(Flt-1)的可溶性表達(dá)形式,因其缺乏胞外區(qū)及跨膜區(qū)這一結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性,使其與VEGF結(jié)合后阻斷其生物學(xué)效應(yīng),從而抑制胎盤血管形成,并增加內(nèi)皮細(xì)胞對胎盤炎癥因子的敏感性,起著促炎作用。早于2004年發(fā)表在新英格蘭雜志上的巢式病例對照研究發(fā)現(xiàn)PE患者血清中sFlt-1表達(dá)明顯高于孕周相同的正常孕婦(4382vs1643pg/mL,p0.01),文章還指出sFlt-1在PE臨床癥狀出現(xiàn)前約5周即出現(xiàn)顯著升高；同類的研究結(jié)果相繼在國內(nèi)外發(fā)表,發(fā)現(xiàn)sFlt-1在PE患者血清、胎盤及羊水中表達(dá)明顯升高,并與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系。因此,sFlt-1即將成為PE病情判斷的重要指標(biāo)。 但目前眾多研究成果多集中于sFlt-1表達(dá)的下游機(jī)制,而對sFlt-1產(chǎn)生的上游機(jī)制研究仍非常有限,因此,進(jìn)行sFlt-1產(chǎn)生機(jī)制探討,對闡明PE發(fā)病機(jī)制及從源頭阻斷其產(chǎn)生均具有重要意義。 由于代謝障礙、炎癥反應(yīng)和腎功能減退等因素,PE患者普遍存在以氧化還原失衡為特征的氧化應(yīng)激。晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)是一組在蛋白質(zhì)、脂肪酸或核酸的氨基基團(tuán)與還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng)所形成的一系列具有高度活性終產(chǎn)物的總稱。AGEs可與各種細(xì)胞表面晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end-products, RAGE)結(jié)合,引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激,激活NADPH氧化酶,導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多,進(jìn)而激活NF-κB,調(diào)控炎癥因子的表達(dá),這一過程在冠心病、糖尿病、自身免疫疾病的多種疾病中起重要作用。正常孕婦存在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài),PE孕婦在此基礎(chǔ)上存在氧化應(yīng)激。另外研究顯示AGEs在PE患者的血清和胎盤中的表達(dá)也明顯高于正常孕婦,而滋養(yǎng)細(xì)胞表面也存在RAGE受體,實(shí)驗(yàn)中得出結(jié)果：PE患者血清中的AGEs濃度為157.8±51.9%(mean±S.D)；而正常孕婦則為116±31.6%,兩者差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.005)。另外,AGEs與滋養(yǎng)細(xì)胞RAGE受體結(jié)合,可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而影響胎盤著床。因此,總結(jié)上述研究結(jié)果：AGEs介導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞損傷在PE的發(fā)生機(jī)制中可能起著重要的作用。 盡管AGEs和sFlt-1都與PE的發(fā)生發(fā)展獨(dú)立相關(guān),但鑒于AGEs與其受體結(jié)合后可引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激,調(diào)控炎癥因子的表達(dá),而PE中,sFlt-1增加了內(nèi)皮細(xì)胞對胎盤釋放炎癥因子的敏感性,也起著促炎作用。因此我們推測PE患者體內(nèi)蓄積的AGEs與sFlt-1產(chǎn)生密切相關(guān),故本課題以人早孕永生滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo為實(shí)驗(yàn)對象,以AGEs為刺激物,檢測HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞刺激后sFlt-1的分泌情況,并初步研究其產(chǎn)生機(jī)制。 第一部分AGEs刺激滋養(yǎng)細(xì)胞分泌sFlt-1 [目的] 相關(guān)研究表明,AGEs-RAGE結(jié)合后可引起內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激,調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá),而該系統(tǒng)在PE患者內(nèi)被廣泛激活；同樣sFlt-1是參與子癇前期發(fā)病的重要“毒性因子”。因此本部分旨在探討PE患者體內(nèi)蓄積的AGEs與sFlt-1的相互關(guān)系,以AGEs為刺激物,檢測滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)sFlt-1的分泌情況,以及AGEs對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的影響。 [方法] 1、各組細(xì)胞侵襲能力測定： 1.1刺激分組：將HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞分別予100μg/mLAGEs、100μg/mL BSA以及空白培養(yǎng)進(jìn)行處理。 1.2將3組接受不同刺激細(xì)胞組置于鋪Matrigel的Transwell小室上,孵育48h后,取小室行固定、染色,并置于光學(xué)顯微鏡下觀察侵襲至Transwell下室的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。 2、不同刺激濃度組sFlt-1mRNA表達(dá)及蛋白分泌量測定： 2.1刺激分組：將HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞分別予濃度為0、50、100、200、300μg/mL AGEs刺激10h。 2.2刺激結(jié)束后RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)sFlt-lmRNA表達(dá),ELISA方法檢測細(xì)胞上清液中sFlt-1蛋白的分泌情況。 3、不同刺激時間組sFlt-1mRNA表達(dá)及蛋白分泌量測定： 3.1刺激分組：以濃度為100μg/mLAGEs分別刺激HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞O、2.5、5、10及15h。 3.2刺激結(jié)束后RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)sFlt-1mRNA表達(dá),ELISA方法檢測細(xì)胞上清液中sFlt-1蛋白的分泌情況。 [結(jié)果] 1、各組HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力改變：與BSA對照及空白培養(yǎng)基組對比,100μg/mL AGEs刺激滋養(yǎng)細(xì)胞后,穿透Matrigel侵襲至Transwell下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少(67.33±10.26vs145.33±5.50及67.33±10.26vs153.66±13.01,兩者均p0.0001),而BSA對照組及空白培養(yǎng)基組之間無明顯差異(p=0.350) 2、AGEs分別以不同濃度刺激HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞后,sFlt-1的mRNA表達(dá)和蛋白的分泌情況：sFlt-1mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液蛋白表達(dá)經(jīng)AGEs刺激后,各組sFlt-1的分泌較對照組呈AGEs劑量依賴性增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05) 3、以濃度為100μg/mL AGEs分別刺激HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞不同時間長度后,sFlt-1的mRNA表達(dá)和蛋白的分泌情況：sFlt-1mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液中sFlt-1蛋白分泌經(jīng)100μg／mL AGEs不同時間長度刺激后,各組sFlt-1的分泌較對照組呈AGEs時間依賴性增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05) [結(jié)論] 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AGEs刺激HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞后,細(xì)胞侵襲能力明顯受到抑制。同時,AGEs刺激HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞,隨刺激濃度及刺激時間增加及延長,sFlt-1的mRNA和蛋白分泌呈依賴性增加,提示PE患者體內(nèi)蓄積的AGEs可是刺激其胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致sFlt-1分泌增加,而這一過程可能參與PE的發(fā)病。 第二部分：AGEs刺激HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞分泌sFlt-1機(jī)制的研究 [目的] AGEs可激活內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶,并導(dǎo)致活性氧ROS產(chǎn)生增加,調(diào)控各種炎癥因子表達(dá)進(jìn)而引起一系列病理反應(yīng),這一過程已經(jīng)在糖尿病、動脈粥樣硬化中被證實(shí)。結(jié)合第一部分研究結(jié)果,本部分旨在探討AGEs刺激HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞分泌sFlt-1機(jī)制的研究,證明AGEs刺激HTR-8/SVne。滋養(yǎng)細(xì)胞后可激活其內(nèi)NADPH氧化酶,導(dǎo)致ROS產(chǎn)生,最終導(dǎo)致sFlt-1的分泌增加。 [方法] 1、DCFH-DA探針檢測AGEs刺激各組HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生情況： 1.1刺激分組： 1.1.1(濃度組)：將HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞分別予AGEs濃度為0、50、100、200、300μg／mL刺激l0min；刺激終止后,行DCFH-DC探針裝載。 1.1.2(抑制劑組)：分別予100μmol/LNADPH氧化酶抑制劑(Apocynin)、10mmol/L ROS清除劑(NAC)預(yù)處理HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞1h后予100μg/mLAGEs刺激1Omin；以單獨(dú)AGEs刺激、BSA及空白培養(yǎng)基處理l0min為對照；刺激終止后,DCFH-DC探針裝載。 1.2不同刺激后HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的檢測： 1.2.1熒光顯微鏡下熒光強(qiáng)度觀察：探針裝載后,在避光環(huán)境下,將細(xì)胞置于藍(lán)光激發(fā)的熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化。 1.2.2流式細(xì)胞儀行各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量比較：探針轉(zhuǎn)載后,將各組細(xì)胞消化、重懸,上機(jī)檢測熒光強(qiáng)度(FITC)強(qiáng)弱變化。 2、各組HTR-8/SVneo刺激后sFlt-1mRNA表達(dá)及蛋白分泌量測定： 2.1刺激分組：分別予NADPH氧化酶抑制劑(Apocynin)、ROS清除劑(NAC)預(yù)處理HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞lh后予100μg/mL AGEs刺激10h；以單獨(dú)AGEs刺激、BSA及空白培養(yǎng)基處理為對照。 2.1刺激結(jié)束后RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)sFlt-1mRNA表達(dá)及ELISA方法檢測細(xì)胞上清液中sFlt-1蛋白的分泌情況。 [結(jié)果] 1、各組細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生情況： 1.1熒光顯微鏡下觀察： 1.1.1AGEs濃度刺激組：各組細(xì)胞經(jīng)AGEs刺激后,ROS產(chǎn)生導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度隨AGEs刺激濃度增加而逐漸增強(qiáng)。 1.1.2抑制劑處理組：分別予Apocynin及NAC預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS較單純用AGEs刺激明顯下降,但兩預(yù)處理組之間無明顯差別。1.2流式細(xì)胞儀檢測各組ROS的產(chǎn)生情況： 1.2.1AGEs濃度刺激組：各組細(xì)胞經(jīng)不同濃度AGEs刺激后,ROS產(chǎn)生導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化較對照組呈AGEs濃度依賴性增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；抑制劑處理組：分別予NADPH氧化酶抑制劑(Apocynin)及ROS清除劑(NAC)預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS較單純用AGEs明顯下降,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.8533±0.171vs4.8133±0.432,2.9067±0.197vs4.8133±0.432,p0.05),而兩預(yù)處理組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.619),但較空白培養(yǎng)基及BSA對照組比較,ROS產(chǎn)生明顯增加,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 2、各組細(xì)胞sFlt-1mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液蛋白分泌檢測：預(yù)處理后,sFlt-1mRNA表達(dá)及細(xì)胞上清液蛋白分泌均較單純用AGEs明顯下降,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),但兩預(yù)處理組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.612,0.805),但較空白培養(yǎng)基及BSA對照組比較,sFlt-1分泌量明顯增加,且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 [結(jié)論] 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AGEs刺激HTR-8/SVneo滋養(yǎng)細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生隨刺激濃度升高而增加,予NADPH抑制劑(Apocynin)及ROS清除劑(NAC)預(yù)處理可使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生及sFl t-1的分泌較單純AGEs刺激減少。結(jié)合第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提出：AGEs刺激可使滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生sFlt-1,本部分證明AGEs通過NADPH氧化酶依賴的信號途徑使細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生增加,最終導(dǎo)致是sFlt-1的產(chǎn)生增多,這一過程可能成為PE發(fā)病機(jī)制中的組成部分。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.246

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1785570