本文選題：Pim-3 + 卵巢癌��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：近年研究發(fā)現(xiàn)Pim-3可抑制凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖并影響細(xì)胞周期,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,成為腫瘤研究中一個(gè)全新的熱點(diǎn),對(duì)Pim-3功能的深入研究將使目前對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)帶來革命性的變化。Pim-3在肝癌、結(jié)腸癌、胃癌等多種腫瘤存在異常表達(dá),并與腫瘤的的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移潛能及術(shù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。同是Pim家族的Pim-1在上皮性卵巢癌中高表達(dá)并發(fā)揮抗凋亡作用,但Pim-3在卵巢癌中的表達(dá)及其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚有待于進(jìn)一步研究。目的:1.檢測(cè)Pim-3基因在卵巢癌組織、良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織中的表達(dá)差異,探討Pim-3表達(dá)量與卵巢癌臨床病理因素之間的關(guān)系;2.構(gòu)建Pim-3過表達(dá)慢病毒真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)導(dǎo)入人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中,篩選獲得Pim-3過表達(dá)單克隆細(xì)胞株;3.探討過表達(dá)Pim-3后卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖、遷移及凋亡等生物學(xué)行為的改變。方法:1.Trizol法提取26例卵巢癌、25例卵巢良性腫瘤及16例正常卵巢組織標(biāo)本的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime-PCR)方法,檢測(cè)各標(biāo)本組織中Pim-3的表達(dá)量,比較三組之間的表達(dá)差異,分析Pim-3基因的表達(dá)量與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系。2.采用RT-PCR方法,自人卵巢癌SKOV3細(xì)胞中提取總RNA,特異性擴(kuò)增Pim-3片段,將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD19-T simple載體,雙內(nèi)切酶切下粘性末端,克隆至慢病毒表達(dá)載體pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP上,測(cè)序鑒定挑選構(gòu)建成功的重組慢病毒真核表達(dá)載體;將陽(yáng)性重組質(zhì)粒及空白質(zhì)粒導(dǎo)入病毒包裝細(xì)胞293T中;收集病毒上清液轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,選用單細(xì)胞有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞株,應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot法分別鑒定Pim-3 mRNA及其蛋白水平的表達(dá)量。3.建立過表達(dá)Pim-3的SKOV3卵巢癌細(xì)胞株后,應(yīng)用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。結(jié)果:1.Pim-3mRNA在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組中的表達(dá)量分別為:2.88±4.57、0.065±0.040及0.028±0.015,Pim-3在卵巢癌組織中的表達(dá)量顯著高于良性卵巢腫瘤組及正常卵巢組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(PO.05),良性腫瘤組與正常組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。卵巢癌組織中的Pim-3基因表達(dá)量與年齡(P=0.53)、有無(wú)腹腔積液(P=0.07)無(wú)關(guān)(P0.05),與臨床分期(P=0.02)、病理分級(jí)(P=0.03)及有無(wú)轉(zhuǎn)移(P=0.03)有關(guān)(P0.05)。2.經(jīng)pMD19-T simple載體和pCDH載體克隆、酶切鑒定及序列分析后,證實(shí)人Pim-3過表達(dá)重組慢病毒真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。感染pCHD-Pim-3重組質(zhì)粒及pCDH空載體的293T細(xì)胞生產(chǎn)的病毒上清分別感染SKOV3細(xì)胞,在熒光顯微下觀察到帶綠色熒光的SKOV3細(xì)胞,應(yīng)用單細(xì)胞有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株,實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western Blot鑒定顯示感染重組質(zhì)粒的SKOV3細(xì)胞中Pim-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于空載體細(xì)胞,Pim-3過表達(dá)細(xì)胞株建立成功。3.經(jīng)CCK8試劑盒檢測(cè)24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后重組質(zhì)粒組OD450值分別為 0.53±0.07、2.17±0.03 及 3.67±0.25,pCDH 空質(zhì)粒組分別為 0.44±0.03,1.53±0.03及2.64±0.40,與空載體轉(zhuǎn)染的SKOV3細(xì)胞相比,過表達(dá)Pim-3可促進(jìn)SKOV3細(xì)胞增殖(P0.05);空白細(xì)胞組、空載體對(duì)照組及重組質(zhì)粒組24小時(shí)細(xì)胞遷移距離分別為3.21±0.23mm、3.14±0.17mm、4.00±0.33mm,過表達(dá)Pim-3后細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)(P0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Pim-3后SKOV3細(xì)胞的凋亡率較pCDH組及空白細(xì)胞組減少(P0.05)。結(jié)論:1.Pim-3 mRNA在卵巢癌組中的表達(dá)量高于卵巢良性腫瘤組及正常卵巢組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,良性腫瘤組與正常組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。卵巢癌組織中的Pim-3基因表達(dá)量與年齡、有無(wú)腹腔積液無(wú)關(guān),與臨床分期、病理分級(jí)及有無(wú)轉(zhuǎn)移有關(guān)。2.成功構(gòu)建了人Pim-3過表達(dá)慢病毒真核表達(dá)載體pCDH-Pim-3,轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞后,篩選獲得Pim-3過表達(dá)的SKOV3卵巢癌單克隆細(xì)胞,Pim-3 mRNA及蛋白表達(dá)水平均上調(diào)。3.Pim-3過表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞的增殖及遷移能力得到增強(qiáng),并抑制了卵巢癌細(xì)胞的凋亡。為深入研究Pim-3在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制、尋找新的診斷治療靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:In recent years , the expression of Pim - 3 gene in ovarian cancer , ovarian cancer , gastric cancer , and the expression of Pim - 3 in ovarian cancer were studied . The expression of Pim - 3 mRNA and protein in ovarian cancer tissue was significantly higher than that in benign ovarian tumor group ( P = 0 . 05 ) .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

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