本文選題：維生素C + 滋養(yǎng)層干細(xì)胞��； 參考：《浙江大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：早在70年前已有文獻(xiàn)報(bào)道,妊娠婦女若缺乏維生素C (vitamin C, VC)則容易出現(xiàn)自發(fā)性流產(chǎn),而補(bǔ)充Vc能減少自發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生。這提示Vc在妊娠維持中可能扮演了重要的角色。本研究室近幾年的研究表明,Vc能誘導(dǎo)人胎盤(pán)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛膜癌細(xì)胞株JEG-3、JAR產(chǎn)生甾體激素(E2和P4)和多肽激素(βhCG),但對(duì)Vc維持妊娠的具體分子機(jī)制尚不清楚。妊娠維持需要胎盤(pán)正常發(fā)育并行使其正常功能,胎盤(pán)的形成則需要其內(nèi)部的滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophoblast stem cell, TSC)。TSC經(jīng)各種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,分化形成各種特異性的滋養(yǎng)層細(xì)胞。Vc是否通過(guò)調(diào)控TSC分化為各種特異性滋養(yǎng)層細(xì)胞的過(guò)程,進(jìn)而影響胎盤(pán)的妊娠維持,尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,深入研究Vc在TSC分化過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制以及對(duì)胎盤(pán)妊娠維持的效應(yīng),對(duì)揭示Vc在妊娠維持中的作用具有重要的科學(xué)意義。本研究通過(guò)體外和體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Vc能促進(jìn)TSC分化以及妊娠維持的過(guò)程。1.在TSC分化的過(guò)程中,研究發(fā)現(xiàn),Vc處理能誘導(dǎo)TSC分化時(shí)Ctsq、PL-Ⅱ、 SynA和Gcml的mRNA表達(dá)增高。Ctsq是迷路層竇狀巨細(xì)胞(sinosoidal trophoblast giant cell, S-TGC)的特異性marker, SynA和Gcml是迷路層合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞的marker,上述結(jié)果提示Vc能促進(jìn)TSC向迷路層細(xì)胞方向進(jìn)行選擇性分化,尤其是S-TGC方向的分化。TSC定向分化為S-TGC是由堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子Hand1調(diào)控的。通過(guò)基因和蛋白質(zhì)水平的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)Vc能增高支配S-TGC分化的轉(zhuǎn)錄因子Hand1的蛋白水平,對(duì)mRNA水平則沒(méi)有影響；核質(zhì)分離實(shí)驗(yàn)顯示,Vc同時(shí)增加TSC胞漿和胞核內(nèi)Hand1的蛋白水平。為再次驗(yàn)證Vc能夠調(diào)控Hand1蛋白的水平,通過(guò)Vc處理外源轉(zhuǎn)染Flag標(biāo)記的Hand1 (Flag-Hand1)人絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3。Western blot和免疫熒光結(jié)果均表明,Vc可以劑量和時(shí)間依賴性提高Hand1的蛋白水平。已有研究發(fā)現(xiàn),TSC向TGC分化是通過(guò)Hand1形成同源二聚體而發(fā)揮作用的。因此,我們通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí),Hand1可以形成同源二聚體,Vc能增加Hand1總蛋白量,從而導(dǎo)致形成同源二聚體的Hand1數(shù)量增多,而對(duì)Hand1本身形成同源二聚體的能力并沒(méi)有影響。上述結(jié)果揭示,Vc主要通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Hand1的蛋白表達(dá)水平,誘導(dǎo)TSC向S-TGC方向分化。2.Vc調(diào)控Hand1蛋白水平的具體機(jī)制。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),不同濃度的Vc處理TSC細(xì)胞1 h,可劑量依賴性降低TSC細(xì)胞中的MAPK信號(hào)通路JNK和P38的磷酸化水平。為探究MAPK信號(hào)通路是否可能參與Vc誘導(dǎo)的S-TGC分化,我們?cè)赩c誘導(dǎo)TSC分化的過(guò)程中,添加JNK和P38激動(dòng)劑Anisomycin,觀察其對(duì)Vc誘導(dǎo)TSC分化的影響。qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Anisomycin能夠劑量依賴性降低Vc誘導(dǎo)的S-TGC的Marker——Ctsq的mRNA水平。同時(shí),Anisomycin能減少內(nèi)、外源性Hand1的蛋白水平。相反,在TSC分化的過(guò)程中,通過(guò)JNK抑制劑SP600125和P38抑制劑SB203580分別處理TSC,以分別抑制JNK和P38信號(hào)通路,是否可以模擬Vc誘導(dǎo)的TSC分化?qPCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),只有SP600125處理能劑量依賴性增高促進(jìn)Ctsq mRNA的表達(dá)水平以及Flag-Hand1的蛋白表達(dá)水平,而SB203580沒(méi)有相似的作用,提示Vc只通過(guò)JNK調(diào)控Hand1蛋白的水平。為進(jìn)一步證實(shí)是JNK調(diào)控了Hand1,將構(gòu)建的激活形式的JNK1 (JNK*)和Hand1共轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞48 h, Western blot檢測(cè)表明,JNK1*可減少Hand1蛋白的水平,而Vc處理并不改變JNK1激活所致Hand1蛋白水平的減少。與此結(jié)果相一致,通過(guò)慢病毒感染JNK1/2 shRNA特異性敲降JEG3中的JNK1/2水平,能增高Hand1蛋白的水平。上述結(jié)果揭示,Vc通過(guò)抑制TSC中JNK1的活性提高Hand1蛋白的水平。為進(jìn)一步探究是否JNK1和Hand1有直接的作用,將JNK1*和Myc-Hand1共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,免疫共沉淀結(jié)果發(fā)現(xiàn),JNK1*與Hand1蛋白有直接的結(jié)合。3.進(jìn)一步探究JNK是如何調(diào)控Hand1蛋白的。之前的結(jié)果表明,JNK激動(dòng)劑Anisomycin處理能降低Hand蛋白的水平,而JNK抑制劑SP600125處理能夠增高Flag-Hand1的蛋白水平,提示是否JNK通過(guò)其激酶活性來(lái)調(diào)控Hand1蛋白的穩(wěn)定性。因此,我們構(gòu)建了持續(xù)失活突變的JNK1*(JNK*APF),將JNK1*APF和JNK1*分別與Hand1共轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞。結(jié)果顯示,JNK1確實(shí)是通過(guò)其激酶活性來(lái)調(diào)控Hand1蛋白的穩(wěn)定性。為探究JNK激酶具體調(diào)控Hand1的哪一個(gè)或哪幾個(gè)氨基酸位點(diǎn),我們通過(guò)磷酸化預(yù)測(cè)軟件GPS分析了Hand1蛋白中潛在的JNK磷酸化位點(diǎn),并分別構(gòu)建其失活突變體。JNK1*和各個(gè)Hand1突變體共轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞48 h,Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),JNK1*不能減少p.S48A突變的Hand1,且使野生型Hand1和其他突變體蛋白位置上移的現(xiàn)象在p.S48A突變后消失。由此推測(cè),第48位點(diǎn)的磷酸化會(huì)減弱Hand1蛋白的穩(wěn)定性。為驗(yàn)證該假設(shè),構(gòu)建了模擬磷酸化形式的p.S48D突變的Hand1,Western blot和免疫熒光結(jié)果均表明,與野生型相比,p.S48A突變能夠增加Hand1的蛋白含量,而p.S48D突變降低Hand1蛋白的含量。為證實(shí)JNK是否是通過(guò)磷酸化Hand1,進(jìn)而使其發(fā)生降解而減少其蛋白的含量,我們用泛素化降解抑制劑MG132處理共轉(zhuǎn)染JNK*和Hand1的JEG-3細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示,MG132能夠阻斷JNK*磷酸化Hand1所導(dǎo)致的減少,表明JNK*磷酸化的Hand1可被泛素化體系識(shí)別并降解。與此結(jié)果相符,將Flag-Hand1和HA-Ubiqutin共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Vc處理能夠減少連接結(jié)合在Hand1蛋白上的泛素的量。以上結(jié)果顯示,JNK通過(guò)其激酶活性調(diào)控Hand1蛋白,使Hand1的第48位絲氨酸(serine)發(fā)生磷酸化,促進(jìn)其泛素化降解。4.Vc對(duì)妊娠維持的影響。為揭示Vc對(duì)妊娠維持的影響,我們通過(guò)Talen技術(shù)構(gòu)建特異性敲除C57小鼠Vc合成限速酶——L-古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶(L-Gulo),使其自身不能合成VC,以觀察缺乏Vc對(duì)小鼠妊娠維持的影響。母鼠交配驗(yàn)到栓后,開(kāi)始斷Vc(E0.5 d),通過(guò)液相色譜對(duì)血清Vc含量進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)E8.5 d的Gulo-/-母鼠體內(nèi)Vc水平很微弱或檢測(cè)不到。取E18.5 d妊娠母鼠,發(fā)現(xiàn)缺乏Vc可促進(jìn)胎鼠的吸收,正常存活的胎鼠重量明顯低于Vc補(bǔ)充組。Western blot檢測(cè)剩余存活胎盤(pán)中的Hand1蛋白,發(fā)現(xiàn)缺乏Vc組胎盤(pán)中的Hand1表達(dá)水平明顯降低。在正常情況下,胎盤(pán)發(fā)育于E13.5 d已基本完成,而在缺乏Vc組未見(jiàn)到胎盤(pán)吸收情況發(fā)生,但通過(guò)對(duì)該妊娠天數(shù)的胎盤(pán)進(jìn)行H-E檢測(cè),發(fā)現(xiàn)缺乏Vc使得胎盤(pán)迷路層結(jié)構(gòu)間質(zhì)結(jié)構(gòu)增多,空隙增大。免疫組化檢測(cè)CK(胎盤(pán)S-TGC的marker)和lamin(胎鼠血管marker),發(fā)現(xiàn)缺乏Vc可使S-TGC位置不均勻分布,胎鼠血管呈直線型,未出現(xiàn)正常情況下網(wǎng)絡(luò)狀交匯分布的現(xiàn)象,提示缺乏Vc可能影響Hand1的表達(dá)水平,以及迷路層S-TGC的形成和分布,進(jìn)而使得母鼠-胎鼠血管交匯處獲得的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足日益增大的胎鼠的需求,從而導(dǎo)致部分胎鼠出現(xiàn)體重下降、嚴(yán)重的即出現(xiàn)妊娠維持失敗而表現(xiàn)為胎兒吸收狀況。綜上所述,本研究從細(xì)胞生物學(xué)的角度闡明了Vc主要通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路上調(diào)Hand1轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性和蛋白水平,進(jìn)而誘導(dǎo)TSC選擇性分化為迷路層S-TGC過(guò)程中的具體調(diào)控。小鼠模型研究發(fā)現(xiàn),缺乏Vc導(dǎo)致胎盤(pán)迷路層結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂,間質(zhì)結(jié)構(gòu)增多,空隙增大。母體血管和胎鼠血管交匯不足,導(dǎo)致胎鼠營(yíng)養(yǎng)獲取不足、體重減輕,甚至妊娠維持失敗。這可能是Vc不足或缺乏導(dǎo)致妊娠維持失敗的主要原因。本研究有助于解釋目前國(guó)際上對(duì)維生素包括Vc、VE等在體內(nèi)補(bǔ)充問(wèn)題引起的極大爭(zhēng)論；同時(shí),將為Vc新的生理學(xué)效應(yīng)、Vc在妊娠中的重要角色、妊娠維持、胎兒發(fā)育的生理基礎(chǔ)等提供新的視角。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714

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10 彭文;戴e，

本文編號(hào)：1734613