本文選題：人羊水干細胞　切入點：卵巢早衰　出處：《吉林大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景:每年全世界有上百萬女性被診斷為癌癥,其中約10%的患者在育齡期,化學治療的不斷發(fā)展與支持性治療的不斷進步使癌癥患者的生存率顯著提高,約90%早期診斷的年輕女性患者可以存活,但是化學治療所帶來的遠期并發(fā)癥的風險卻日益突出。其中,最主要的遠期影響包括由卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)或者卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)導(dǎo)致的早期絕經(jīng)和不育。對于年輕的婦科腫瘤患者,雖然接受了保留生育功能的手術(shù),卻因術(shù)后化學治療對生殖系統(tǒng)的損害而仍然無法擁有生育能力,嚴重影響育齡患者的生存質(zhì)量。隨著癌癥年輕化趨勢的日益明顯和年輕女性癌癥患者存活率的提高,患者對有效的個性化生育保護措施的需求也隨之增加。因此,在不影響癌癥治療的基礎(chǔ)上,提高患者的生存質(zhì)量、保護卵巢儲備功能和預(yù)防不孕不育已經(jīng)成為醫(yī)生和患者共同面臨的首要問題。臨床研究和動物實驗表明,在惡性腫瘤的化學治療過程中,化療藥物可導(dǎo)致卵巢組織結(jié)構(gòu)紊亂,影響卵泡的啟動、生長和成熟過程,不同的化療藥物對卵巢的損傷途徑和嚴重程度不同,但具體機制尚不明確。目前,臨床上預(yù)防或治療化療所致卵巢早衰的方法主要包括:促性腺激素釋放激素治療,激素替代治療,生育能力冷凍保存技術(shù)。但是每種方法都有各自的局限性,尚不能廣泛應(yīng)用于臨床。隨著再生醫(yī)學的發(fā)展,干細胞已經(jīng)應(yīng)用于臨床多種疾病的治療,其在組織修復(fù)與再生中發(fā)揮重要作用。目前,已有研究表明,干細胞移植具有修復(fù)卵巢結(jié)構(gòu)、改善卵巢功能和提高生育能力的作用,但作用機制尚不明確。近年來,人羊水干細胞(human amniotic fluid stem cells,h AFSc)的發(fā)現(xiàn)和研究為干細胞的應(yīng)用開辟了新的研究領(lǐng)域。由于羊水來源廣泛、獲取簡便、創(chuàng)傷小、免疫原性低、增殖分化能力強、無倫理道德方面的限制,在醫(yī)學領(lǐng)域中具有廣泛應(yīng)用前景,h AFSc有望成為保護和修復(fù)化療所致卵巢損傷的新方法,為保留生育功能的年輕女性癌癥幸存者帶來希望。研究目的:研究h AFSc的生物學特性與應(yīng)用安全性;建立穩(wěn)定的順鉑所致大鼠卵巢損傷的動物模型和大鼠卵巢顆粒細胞損傷的體外模型,探究順鉑損傷卵巢的可能途徑;研究h AFSc預(yù)防性保護和治療性修復(fù)順鉑所致大鼠卵巢損傷的可行性及可能機制,以及h AFSc體外修復(fù)順鉑損傷的顆粒細胞的可行性及可能途徑。為化療所致卵巢損傷的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ),為臨床上保護卵巢功能提供全新的思路和策略。實驗方法:第1部分:h AFSc的分離、培養(yǎng)、鑒定與生物學特性分析1.通過產(chǎn)前診斷或自愿引產(chǎn)的途徑采集人孕中期羊水標本,采用差異貼壁與機械分離的方法收集和純化h AFSc;2.通過細胞形態(tài)學觀察、流式細胞術(shù)檢測細胞表面干細胞標志物的表達、MTT檢測細胞增殖能力,對分離培養(yǎng)的h AFSc進行初步鑒定;3.通過MTT方法檢測h AFSc凍存前后增殖能力、Western Blot方法檢測不同代數(shù)h AFSc多能干細胞標志物Oct3/4、Nanog和Sox-2的表達、定向誘導(dǎo)h AFSc向脂肪細胞和骨細胞分化的方法,對h AFSc的生物學特性進行分析;4.通過給裸鼠皮下注射h AFSc的方法檢測h AFSc的成瘤性,評估h AFSc在使用中的安全性。第2部分:順鉑誘導(dǎo)大鼠卵巢損傷模型的建立及損傷途徑的研究將有正常動情周期的8周齡SD大鼠隨機分為4組:對照組(0.9%生理鹽水),低劑量順鉑給藥組(1.0mg/kg)、中劑量順鉑給藥組(1.5mg/kg)、高劑量順鉑給藥組(2.0mg/kg)。造模前各組尾尖采血收集血樣,連續(xù)腹腔注射順鉑6天,分別于第7天、第15天、第30天、第45天處死大鼠,獲取血液樣本、雙側(cè)卵巢和子宮。1.實驗中觀察大鼠一般狀態(tài),稱量體重,繪制大鼠生存曲線;2.通過卵巢、子宮的大體觀察、HE染色和卵泡計數(shù),評估不同濃度順鉑對大鼠卵巢和子宮組織結(jié)構(gòu)的損傷程度;3.通過Elisa方法檢測大鼠血清FSH、E2水平,分析不同濃度順鉑對卵巢內(nèi)分泌功能的影響;4.通過TUNEL法和Western Blot方法分別檢測大鼠卵巢組織凋亡情況和FSHR蛋白的表達,用以探究順鉑對卵巢損傷的可能途徑。第3部分:h AFSc預(yù)防和治療順鉑所致大鼠卵巢損傷的體內(nèi)實驗選用PHK26熒光染料標記第3代h ASFc,分別用于h AFSc移植的治療實驗和預(yù)防實驗。將有正常動情周期的8周齡SD大鼠納入實驗。h AFSc治療卵巢損傷的研究中,大鼠隨機分為3組,對照組(0.9%生理鹽水)、模型組(1.5mg/kg順鉑連續(xù)注射6天)、治療組(1.5mg/kg順鉑連續(xù)注射6天+h AFSc尾靜脈移植),治療組于連續(xù)注射6天順鉑后1天(第7天)尾靜脈移植h AFSc。于順鉑使用第1天(造模前)、第7天、第30天尾尖采血,并分別于第15天、第45天處死大鼠,獲取血樣,剖取卵巢。1.實驗過程中觀察大鼠一般狀態(tài),卵巢組織冰凍切片觀察PKH26標記的h AFSc在卵巢中的存活與分布;2.Elisa方法檢測大鼠血清FSH、E2水平分析h AFSc移植對卵巢內(nèi)分泌功能的影響;3.通過對卵巢的大體觀察、HE染色和各級卵泡計數(shù)評估h AFSc預(yù)防和修復(fù)大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)的效果;4.通過Western Blot方法檢測PI3K/PTEN/Akt信號通路中PTEN、p-PTEN、Akt、p-Akt和信號通路下游分子FOXO3a、p-FOXO3a、GSK3β、p-GSK3β蛋白的表達,探究h AFSc預(yù)防性移植在順鉑作用期間對卵巢原始卵泡的保護機制;5.通過Western Blot方法檢測經(jīng)典凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達,初步研究h AFSc移植對順鉑所致卵巢組織細胞凋亡的影響。h AFSc預(yù)防卵巢損傷的研究中,大鼠隨機分為3組,對照組(0.9%生理鹽水)、模型組(1.5mg/kg順鉑連續(xù)注射6天)、預(yù)防組(h AFSc尾靜脈移植+1.5mg/kg順鉑連續(xù)注射6天),預(yù)防組于順鉑注射前2天尾靜脈移植h AFSc。于干細胞移植前(即順鉑使用前2天)、順鉑使用第30天尾靜脈采血,并分別于第7天、第15天、第45天處死大鼠,獲取血樣,剖取卵巢。實驗方法同h AFSc治療卵巢損傷的研究。第4部分:h AFSc修復(fù)順鉑所致大鼠卵巢顆粒細胞損傷的體外實驗1.解剖顯微鏡下分離提取SD大鼠卵巢顆粒細胞,進行原代培養(yǎng);2.通過細胞形態(tài)學觀察、免疫熒光染色檢測顆粒細胞FSHR的表達對提取的細胞進行鑒定,通過MTT方法檢測顆粒細胞增殖活力,分析顆粒細胞的生長狀態(tài);3.通過MTT方法檢測顆粒細胞增殖抑制率、結(jié)晶紫染色方法觀察細胞形態(tài)變化、DAPI染色檢測顆粒細胞凋亡的情況,綜合分析不同濃度順鉑(0mg/L、1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L)不同作用時間(24h、48h)對卵巢顆粒細胞生長和凋亡影響,選擇合適的順鉑濃度和作用時間,建立順鉑所致大鼠卵巢顆粒細胞損傷的體外模型;4.通過Western Blot方法檢測顆粒細胞FSHR蛋白的表達,探究順鉑對顆粒細胞FSHR蛋白表達的影響;5.通過Transwell小室(8μm孔徑),將h AFSc與正常顆粒細胞或順鉑損傷的顆粒細胞共培養(yǎng),檢測h AFSc穿過聚碳酸酯膜的數(shù)量,分析h AFSc向受損顆粒細胞定向遷移的能力;6.選用Transwell小室(0.4μm孔徑),將h AFSc與正常顆粒細胞或順鉑損傷的顆粒細胞共培養(yǎng),通過TUNEL法檢測顆粒細胞凋亡、Western Blot方法檢測顆粒細胞FSHR蛋白表達,分析h AFSc修復(fù)受損顆粒細胞的能力和可能途徑。實驗結(jié)果:第1部分:1.分離純化的h AFSc形態(tài)均一,成纖維樣細胞呈旋渦狀或放射狀排列,并呈集落樣生長;2.h AFSc表達多能干細胞的標志物Oct3/4、CD117、SSEA-4;表達間充質(zhì)干細胞標志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105;表達MHCI類分子HLA-ABC,不表達MHCII類分子HLA-DR;不表達造血干細胞標志物CD34、CD45;3.第15代h AFSc仍保持較高的增殖能力,不同代數(shù)h AFSc之間多能干細胞特異性蛋白Oct3/4、Nanog、Sox-2的表達無明顯差異;4.h AFSc可向脂肪細胞、骨細胞分化;5.h AFSc不具有成瘤性。第2部分:1.各濃度順鉑均導(dǎo)致大鼠體重降低,高劑量順鉑組大鼠死亡率高;2.各濃度順鉑均可使大鼠血清FSH升高、E2降低。順鉑使用第45天時,中、高劑量組FSH仍保持較高水平,E2仍保持較低水平,而低劑量組在45天時FSH和E2水平已有明顯恢復(fù);3.中劑量順鉑可導(dǎo)致大鼠卵巢和子宮萎縮,影響卵巢各級卵泡數(shù)量。順鉑使用第7天時,卵巢中原始卵泡減少,竇前卵泡增多,竇狀卵泡減少,閉鎖卵泡增多;第30天時,閉鎖卵泡增多,其它各級卵泡均顯著減少,卵巢間質(zhì)血管減少,纖維化嚴重;4.順鉑可導(dǎo)致生長卵泡中顆粒細胞凋亡,卵巢中FSHR蛋白表達減少。第3部分:1.PKH26標記的h AFSc可以向順鉑損傷的大鼠卵巢遷移并長時間存活;2.h AFSc預(yù)防性或治療性移植,均可改善大鼠FSH、E2水平,預(yù)防性保護的效果優(yōu)于順鉑損傷后的治療效果;3.h AFSc預(yù)防性或治療性移植對卵巢結(jié)構(gòu)具有保護和修復(fù)作用,原始卵泡和各級生長卵泡數(shù)量較模型組顯著增多,其中,預(yù)防性移植h AFSc對原始卵泡的保護效果最為明顯,效果明顯優(yōu)于治療性移植組;4.與對照組相比,順鉑可以顯著增加PI3K/PTEN/Akt信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化與非磷酸化的比例,而預(yù)防性移植h AFSc,可以顯著降低由順鉑導(dǎo)致的磷酸化與非磷酸化蛋白比例增高的作用;5.與對照組相比,順鉑可以上調(diào)Bax表達,下調(diào)Bcl-2表達,而治療組和實驗組Bax表達均較相應(yīng)模型組顯著降低,Bcl-2表達均較相應(yīng)模型組顯著升高。第4部分:1.原代大鼠卵巢顆粒細胞呈多角形、星形或梭形,高表達FSHR蛋白,細胞經(jīng)過1-2天的潛伏期進入對數(shù)生長期,第6天開始進入平臺期,第8天細胞開始退化;2.順鉑可以抑制顆粒細胞增殖,增加顆粒細胞凋亡,2.5mg/L濃度順鉑作用48h的顆粒細胞出現(xiàn)明顯的凋亡改變:核固縮、核碎裂、核溶解,出現(xiàn)凋亡小體,造模后,細胞死亡率低,狀態(tài)穩(wěn)定;3.順鉑可以降低顆粒細胞FSHR蛋白的表達,1.25mg/L順鉑作用48h時對顆粒細胞增殖沒有影響,但可以誘導(dǎo)顆粒細胞FSHR表達的減少;4.h AFSc可以向順鉑損傷的顆粒細胞定向遷移;5.h AFSc可以抑制順鉑所致的顆粒細胞凋亡,增加受損顆粒細胞FSHR蛋白的表達。結(jié)論:1.h AFSc增殖能力強且穩(wěn)定,具有低免疫原性,不具有成瘤性,應(yīng)用安全,在干細胞治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。2.1.5mg/kg濃度順鉑連續(xù)腹腔注射6天,可以建立穩(wěn)定的順鉑所致大鼠卵巢損傷的動物模型,2.5mg/L濃度順鉑作用48h可以建立穩(wěn)定的順鉑所致大鼠卵巢顆粒細胞損傷的體外模型。模型穩(wěn)定可靠,可重復(fù)性高。3.順鉑對卵巢具有損傷作用,其損傷作用可能與促進原始卵泡的激活、促進顆粒細胞凋亡、降低FSHR蛋白表達有關(guān)。4.h AFSc移植可以預(yù)防性保護和治療性修復(fù)順鉑損傷的卵巢結(jié)構(gòu)和功能,預(yù)防性移植的效果優(yōu)于損傷后移植的治療效果,尤其對原始卵泡的保護作用顯著。5.h AFSc預(yù)防性保護作用可能是通過抑制PI3K/PTEN/Akt信號通路的激活,從而減少順鉑對原始卵泡的激活作用、維持卵巢儲備功能實現(xiàn)的。6.h AFSc治療性修復(fù)作用可能是通過抑制卵巢顆粒細胞凋亡、增加FSHR蛋白表達,維持生長卵泡發(fā)育,從而間接抑制原始卵泡激活而實現(xiàn)的。
[Abstract]:鐮旂┒鑳屾櫙:姣忓勾鍏ㄤ笘鐣屾湁涓婄櫨涓囧コ鎬ц璇婃柇涓虹檶鐥，

本文編號：1729291