本文選題：宮頸癌　切入點(diǎn)：微小RNA　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景宮頸癌的發(fā)病率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占第二位,僅次于乳腺癌,全世界范圍內(nèi)每年新增病例數(shù)逾50萬,其中大部分在發(fā)展中國家,我國是宮頸癌大國,每年新增病例數(shù)超過13萬,因?qū)m頸癌的死亡人數(shù)每年有6萬之多。近年來,隨著HPV疫苗的使用、宮頸癌早期篩查技術(shù)方法的開展等一、二級預(yù)防方法的應(yīng)用,其發(fā)病率有所降低,但是因?yàn)镠PV疫苗仍未在世界范圍內(nèi)全面應(yīng)用,經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)仍未全面開展早期篩查,宮頸癌的死亡率仍居高不下,仍是嚴(yán)重危害婦女健康的疾病之一。眾所周知,浸潤和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌預(yù)后不良的主要原因,因此對其侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)、系統(tǒng)的研究,對開展個(gè)體化的靶向干預(yù)和治療具有重大意義。MicroRNAs與腫瘤的關(guān)系一直是近年來腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),microRNAs是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子,其長度約在18-25nt之間,通過與靶mRNA的3’非編碼區(qū)(3’-UTR)互補(bǔ)結(jié)合導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯受抑制而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,參與一系列的重要生命進(jìn)程,包括細(xì)胞增殖、分化、惡變及凋亡等等。microRNAs調(diào)節(jié)著人類大約三分之一的基因表達(dá),而且與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。其中microRNA-21(miR-21)是發(fā)現(xiàn)較早、研究較多的一種microRNAs,在多種惡性腫瘤組織及細(xì)胞中均呈高表達(dá),失調(diào)的miR-21通過作用于多種腫瘤抑制因子,如PDCD4、 PTEN、maspin、TPM1、BMPRI、sprouty2等,參與與惡性腫瘤細(xì)胞的增生、浸潤轉(zhuǎn)移和抗凋亡等生物學(xué)行為,miR-21在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮類似癌基因的作用,可被開發(fā)為惡性腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。大量研究表明miR-21在宮頸癌組織中表達(dá)是升高的,目前已知高危型人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)感染是宮頸癌主要發(fā)病原因,HPV整合入宿主細(xì)胞基因組后,可以導(dǎo)致被整合細(xì)胞遺傳學(xué)的改變而致其癌變。人類的miR-21基因位于染色體17q23.2脆性位點(diǎn)區(qū)域FRA17B,此區(qū)域恰好是HPV16容易整合的位點(diǎn),可以推測miR-21基因鄰近HPV整合位點(diǎn)處可能與其在宮頸癌中表達(dá)水平升高有關(guān)還有研究發(fā)現(xiàn),在宮頸癌Hela細(xì)胞系中抑制miR-21的表達(dá)后,明顯抑制Hela細(xì)胞的增殖能力。在體外培養(yǎng)宮頸鱗癌細(xì)胞系中還發(fā)現(xiàn)miR-21可以通過調(diào)節(jié)其靶基因CCL20的表達(dá),來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程；另外,miR-21的在宮頸癌中的表達(dá)量與宮頸癌患者的臨床期別及淋巴轉(zhuǎn)移等有關(guān)。這些研究充分說明了miR-21與宮頸癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,而關(guān)于其調(diào)控宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制尚未完全明確。近年來,對于惡性侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究取得了較大的進(jìn)展,目前的共識是：惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多基因調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程,包括腫瘤細(xì)胞局部浸潤、穿入血管壁、轉(zhuǎn)運(yùn)、穿出血管壁和遠(yuǎn)處種植,而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)過程可能是上皮性惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的始發(fā)事件。EMT是指上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性,以上皮細(xì)胞特征的喪失和間質(zhì)細(xì)胞特性的獲得為主要特征,進(jìn)而誘導(dǎo)上皮細(xì)胞獲得遷移侵襲的能力,參與了人體許多的生理病理過程,包括胚胎發(fā)生、器官分化、組織炎癥、創(chuàng)傷愈合等。EMT的特征是細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲,當(dāng)然也就包括了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。已有研究證實(shí),EMT在多種上皮性惡性腫瘤的原發(fā)浸潤和繼發(fā)轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵的作用。microRNAs調(diào)節(jié)著人類近三分之一的基因表達(dá),其必然也會調(diào)控參與EMT過程的相關(guān)基因的表達(dá)。目前,已有研究證實(shí)有多種microRNAs參與調(diào)控惡性腫瘤的EMT過程。關(guān)于胰腺癌的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),miR-200c可正性調(diào)控E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的表達(dá),從而抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-200通過下調(diào)Fas相關(guān)磷酯酶-1(FAP-1),從而抑制腫瘤EMT的發(fā)生。已知miR-34a是起抑癌作用一種microRNAs,在大多數(shù)腫瘤組織中呈低表達(dá),而SIRT1、Notch1和Snail1等作為miR-34a的下游靶基因,也是EMT過程的重要調(diào)控因子。最近有一項(xiàng)關(guān)于膽管癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-21可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞的EMT過程促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移。研究已證明miR-21與宮頸癌的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān),其具體機(jī)制尚未完全明確;EMT過程又在上皮性惡性腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中起重要作用；我們推測miR-21是否通過調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的EMT過程,從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移,關(guān)于這方面研究,目前國內(nèi)外未見相關(guān)的報(bào)道。研究目的本研究旨在通過臨床組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn)探討miR-21與宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系,EMT過程的關(guān)鍵分子與宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系,miR-21與EMT過程關(guān)鍵分子之間的關(guān)系；通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-21對宮頸癌細(xì)胞EMT過程及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響,揭示miR-21是否通過調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的EMT過程而影響其浸潤轉(zhuǎn)移,為尋找宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)目標(biāo)靶點(diǎn),阻遏宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移過程,開展基因靶向干預(yù)和個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。研究材料和方法1.組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn)1.1收集45例宮頸癌手術(shù)后的新鮮組織標(biāo)本,標(biāo)本包括宮頸癌組織及癌旁正常的宮頸組織,若術(shù)中發(fā)現(xiàn)可疑轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織,一并取下,待病理證實(shí)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織,亦用于實(shí)驗(yàn),最終經(jīng)病理證實(shí)所取淋巴結(jié)中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌者15例。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-21在45例宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織中的相對表達(dá)量,同時(shí)檢測15例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌灶組織中miR-21的表達(dá)量。對比正常組織、癌組織、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中miR-21的表達(dá)差異,分析miR-21的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。1.2同樣的組織標(biāo)本,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測宮頸癌組織,正常宮頸組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1mRNA的相對表達(dá)量差異,分析ZEB1mRNA的表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。同時(shí)分析在宮頸癌組織中miR-21與ZEB1mRNA的表達(dá)的相關(guān)性。1.3免疫組化技術(shù)檢測宮頸癌組織及正常宮頸組織中EMT相關(guān)蛋白ZEB1蛋白、E-鈣粘蛋白、波形蛋白的表達(dá),探討EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)情況與宮頸癌臨床病理特征之間的關(guān)系,并分析它們相互之間的關(guān)聯(lián)性,探討宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中是否發(fā)生了EMT過程。2.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)2.1選擇人宮頸腺癌細(xì)胞株Hela及鱗癌細(xì)胞株Siha作為體外細(xì)胞模型,用Lipofectamine 2000法將miR-21 mimic和miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)入實(shí)驗(yàn)細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株,設(shè)陰性及空白對照組,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞miR-21的表達(dá)量的改變。2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的體外遷移侵襲能力的改變,驗(yàn)證miR-21表達(dá)量的改變對宮頸癌細(xì)胞體外遷移侵襲能力的影響。2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測改變宮頸癌細(xì)胞miR-21表達(dá)量后,其EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1及snail mRNA的表達(dá)差異,Western Blot技術(shù)檢測EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin的表達(dá)差異,驗(yàn)證在宮頸癌細(xì)胞中miR-21對EMT過程關(guān)鍵分子表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果1.組織標(biāo)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示,miR-21在宮頸癌組織中的相對表達(dá)量高于相應(yīng)的正常宮頸組織(P0.05),淋巴轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)量高于原發(fā)癌組織(P0.05)。且宮頸癌組織中miR-21的表達(dá)量與宮頸癌肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、宮旁浸潤與否有顯著相關(guān)性(P0.05)；與患者年齡、腫瘤大小及病理類型無顯著相關(guān)性(P0.05) 另外還發(fā)現(xiàn)在HPV16陽性的宮頸癌組織中高于非HPV16陽性的癌組織(P0.05)。1.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示,ZEB1 mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)高于相對應(yīng)的正常宮頸組織(P0.05),淋巴轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)高于原發(fā)癌組織(P0.05)。且ZEB1mRNA的表達(dá)量與宮頸癌肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有顯著相關(guān)性(P0.05)。與患者年齡、腫瘤大小、宮旁浸潤與否、病理類型無有顯著相關(guān)性(P0.05)。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中miR-21的表達(dá)與ZEB1mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.841,P0.05)。1.3免疫組化結(jié)果顯示宮頸癌組織中ZEB1蛋白表達(dá)高于相對應(yīng)的正常宮頸組織,與宮頸癌肌層浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有顯著相關(guān)性(P0.05)。與相應(yīng)的正常宮頸組織相比,E-cadherin在宮頸癌組織中呈低表達(dá),與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有顯著相關(guān)性(P0.05)。相反,Vimentin在宮頸癌組織中呈高表達(dá)(P0.05),也與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有顯著相關(guān)性(P0.05)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中ZEB1蛋白的表達(dá)與E-cadherin呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.862,P0.001),與Vimentin表達(dá)未呈明顯相關(guān)性(rs=-0.244,P0.05)。2.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1體外培養(yǎng)人宮頸腺癌細(xì)胞株Hela及鱗癌細(xì)胞株Siha,利用脂質(zhì)體2000成功轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染miR-21-mimic組的Hela和Siha細(xì)胞的miR-21表達(dá)量較對照組升高,而轉(zhuǎn)染miR-21-inhibitor后Hela細(xì)胞和Siha細(xì)胞的miR-21表達(dá)量下降。2.2利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同組中宮頸癌細(xì)胞的體外遷移能力變化,結(jié)果顯示,Hela-miR-21-mimic組的細(xì)胞遷移能力明顯高于對照組,Siha-miR-21-mimic組細(xì)胞遷移能力也明顯高于對照組,而Hela-miR-21-inhibitor組的細(xì)胞遷移能力明顯低于對照組,Siha-miR-21-inhibitor組的細(xì)胞遷移能力明顯低于對照組。2.3利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測不同組中宮頸癌細(xì)胞的體外侵襲能力變化,結(jié)果顯示,Hela-miR-21-mimic組的細(xì)胞侵襲能力明顯高于對照組,Siha-miR-21-mimic組細(xì)胞侵襲能力也明顯高于對照組,而Hela-miR-21-inhibitor組的細(xì)胞侵襲能力明顯低于對照組,Siha-miR-21-inhibitor組的細(xì)胞侵襲能力也明顯低于對照組。2.4實(shí)時(shí)熒光定量法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1及snail的mRNA表達(dá)量變化,結(jié)果顯示,Hela-miR-21-mimic組細(xì)胞和Siha-miR-21-mimic組細(xì)胞的ZEB1及snail mRNA的表達(dá)較對照組升高(P0.05);Hela-miR-21-inhibitor組細(xì)胞和Siha-miR-21-inhibitor組細(xì)胞中ZEB1及snail mRNA的表達(dá)均較對照組降低(P0.05)。2.5 Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)的EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)差異,結(jié)果顯示,Hela-miR-21-mimic組細(xì)胞和Siha-miR-21-mimic組細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)降低,Vimentin、N-cadherin蛋白的表達(dá)量升高；Hela-miR-21-inhibitor組細(xì)胞和Siha-miR-21-inhibitor組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)量升高,而Vimentin、N-cadherin蛋白的表達(dá)量均降低。結(jié)論1.miR-21在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常宮頸組織,在淋巴轉(zhuǎn)移癌組織中高于其原發(fā)癌組織,且與宮頸癌肌層浸潤深度、宮旁浸潤與否、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有關(guān),而與患者年齡、腫瘤大小、病理類型無關(guān),提示在宮頸癌組織中,miR-21可能起類似癌基因的作用,促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移。另外在HPV16型陽性的宮頸癌組織標(biāo)本中升高,提示miR-21在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用可能與HPV16感染關(guān)系密切。2.EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1 mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常宮頸組織,淋巴轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)高于原發(fā)癌組織,且ZEB1 mRNA的表達(dá)與宮頸癌肌層浸潤深度、宮旁浸潤與否、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有關(guān)。免疫組化結(jié)果亦顯示ZEB1蛋白在宮頸癌組織中高表達(dá),E-cadherin在宮頸癌組織中低表達(dá),Vimentin在宮頸癌組織中呈高表達(dá),且與宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否、肌層浸潤深度等有關(guān),提示了在宮頸癌浸潤轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)生了EMT過程。3.宮頸癌組織中ZEB1蛋白與E-cadherin蛋白的表達(dá)情況負(fù)相關(guān),miR-21的表達(dá)又與ZEB1mRNA的表達(dá)呈正相關(guān)。體外細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增加宮頸癌細(xì)胞的miR-21表達(dá)量,可以促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞體外的侵襲轉(zhuǎn)移能力；降低宮頸癌細(xì)胞的miR-21表達(dá)量,抑制了宮頸癌細(xì)胞體外侵襲轉(zhuǎn)移能力；miR-21正性調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1及snail mRNA表達(dá),上調(diào)促進(jìn)EMT的相關(guān)蛋白Vimentin、N-cadherin的表達(dá)量,下調(diào)抑制EMT的蛋白E-cadherin的表達(dá)。提示miR-21可能通過調(diào)控宮頸癌的EMT過程,進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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