本文選題：孕期吸煙　切入點(diǎn)：乳鼠　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文

【摘要】：先天性心臟病簡稱為先心病,主要類型包括：房間隔缺損,室間隔缺損,心室雙流出通道,主動脈騎跨于右心室,三尖瓣返流、心室發(fā)育不良和先天性室壁肥厚等。大多數(shù)類型的先天性心臟病可伴隨著兒童發(fā)育的終生,導(dǎo)致先心病兒童的住院率和死亡率增加。 目前,先天性心臟病的發(fā)病因素主要包括先天性的遺傳因素和胚胎發(fā)育的環(huán)境因素,遺傳因素包括基因突變、DNA序列改變、染色體數(shù)目異常等。隨著環(huán)境污染的加重,環(huán)境因素逐漸成為先天性心臟病的主要發(fā)病因素之一。現(xiàn)有的研究表明先天性心臟病相關(guān)的危險因素主要有：母親在妊娠早期感染病毒、服用致畸性的藥物、飲酒、主動吸煙或暴露在被動吸煙的環(huán)境中、接觸甲醛或化學(xué)試劑等。吸煙是心血管系統(tǒng)疾病的相關(guān)危險因素之一,Geelhoed等人的研究結(jié)果表明,孕婦在懷孕期間持續(xù)吸煙5支／天時,其胎兒的臍動脈阻力升高,升主動脈血流量和主動脈根部內(nèi)徑減小,這些心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和血流量的改變很可能與胎兒的體重下降相關(guān)。此外,現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)吸煙還是妊娠期胎兒先天性心臟錐干畸形、肺靜脈異位回流、房室間隔缺損以及阻塞性心臟缺陷的相關(guān)危險因素,其發(fā)生的機(jī)制尚未清楚。 已有的研究表明,心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Tbx5、Nkx2.5和Baf60c在心臟的正常發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。首先,染色質(zhì)重塑復(fù)合物Baf60c能夠改變心臟目的基因的緊密結(jié)構(gòu),介導(dǎo)GATA4、Tbx5和Nkx2.5等心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與目的基因結(jié)合,從而促進(jìn)心臟的發(fā)育。其次,GATA4能與Tbx5和Nkx2.5發(fā)生相互作用,調(diào)控心肌細(xì)胞的分化和增殖。心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Tbx5、Nkx2.5和Baf60c的表達(dá)異常或功能缺失可導(dǎo)致不同類型的先天性心臟病如房間隔缺損、室間隔缺損、單心室和雙心室流出通道等。 然而,轉(zhuǎn)錄因子與心臟目的基因的結(jié)合能力和Baf60c的表達(dá)水平與基因組組蛋白的甲基化狀態(tài)相關(guān)。UTX是組蛋白H3的27位賴氨酸位點(diǎn)三重甲基化H3K27me3的去甲基化酶,一方面,UTX能夠去除Baf60c增強(qiáng)子上抑制性的H3K27me3,從而調(diào)節(jié)Baf60c的表達(dá)；另一方面,UTX能夠去除心臟關(guān)鍵基因上的H3K27me3,促進(jìn)心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Tbx5、Nkx2.5和Brg1與目的基因結(jié)合,從而激活心臟基因的表達(dá)和心臟的發(fā)育。 綜上所述,心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(T)、Baf60c(B)和UTX(U)組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在心臟的正常發(fā)育過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,這屬于表觀遺傳學(xué)的范疇。首先,心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和染色質(zhì)重塑復(fù)合因子Baf60c的正常表達(dá)量是心臟關(guān)鍵基因激活的基礎(chǔ)；其次,UTX和其介導(dǎo)的組蛋白H3K27去甲基化修飾是心臟發(fā)育的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié),其機(jī)制主要包括兩個方面,一方面,UTX調(diào)控染色質(zhì)重塑復(fù)合因子如Baf60c的表達(dá),從而改變?nèi)旧w的緊密結(jié)構(gòu),促進(jìn)Baf60c介導(dǎo)的心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與心臟目的基因結(jié)合,另一方面,其能夠通過去除心臟關(guān)鍵基因上抑制性的H3K27me3,易化心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和Brgl與目的基因結(jié)合,啟動心臟的正常發(fā)育途徑。 盡管吸煙是先天性心臟病的相關(guān)危險因素,而TBU是正常心臟發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò),然而,目前尚缺乏對吸煙相關(guān)的心臟發(fā)育不良的實(shí)驗(yàn)研究及其與TBU之間的關(guān)系的探討。本論文采用SD懷孕大鼠為實(shí)驗(yàn)材料,研究早期接受被動吸煙和尼古丁干預(yù)對大鼠胚胎心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響,并探討其分子和表觀遺傳學(xué)機(jī)制,為先天性心臟病的預(yù)防及表觀分子靶點(diǎn)的預(yù)測提供基礎(chǔ)。 本論文的第一部分將SD懷孕大鼠置于全自動被動吸煙裝置內(nèi)進(jìn)行被動吸煙處理,采用高分辨率超聲Doppler觀察出生一天后的乳鼠左心室結(jié)構(gòu)和左右心室血流狀況。第二部分于懷孕后8.5天(GD8.5)、GD13.5和出生后一天采集各組的大鼠胚胎或乳鼠心臟組織,提取RNA或蛋白,檢測心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA4、 Nkx2.5、Tbx5、染色質(zhì)重塑復(fù)合因子Baf60c、組蛋白修飾酶UTX和心臟關(guān)鍵基因Myl2的表達(dá)水平,以闡明被動吸煙與心臟發(fā)育不良的關(guān)系,并探討其分子和表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制。第三部分選取香煙中的有害物質(zhì)尼古丁在早期對懷孕SD大鼠進(jìn)行灌胃處理,于出生一天后采用高分辨率超聲Doppler觀察乳鼠左心室結(jié)構(gòu),并且采集該時期各組乳鼠心臟組織,采用Western-Blot檢測乳鼠心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Tbx5的表達(dá)情況,以驗(yàn)證尼古丁是否可以影響心臟的發(fā)育及其對心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的影響。 第一部分孕期吸煙對SD大鼠胚胎心臟發(fā)育的影響 目的：觀察孕期吸煙對SD大鼠胚胎心臟發(fā)育的影響及心臟異常發(fā)育的類型。方法：將懷孕SD母鼠隨機(jī)分為四組：正常對照組,10支煙/天/組、20支煙/天/組、40支煙/天/組,并于孕期0.5天(GD0.5)后開始給予吸煙處理直至分娩。采用超聲多普勒Vevo2000檢測出生后一天(PND1)的新生乳鼠的左心室結(jié)構(gòu)及其心臟功能；采用Color-Doppler檢測心室血流方向,以確認(rèn)室間隔的發(fā)育是否異常；采用精密電子天平記錄PND1的新生乳鼠的體重和心臟重量,并計(jì)算心臟重量/體重比值。采用HE染色技術(shù)觀察乳鼠的心臟室壁發(fā)育情況。 結(jié)果：(1)各組新生乳鼠心臟重量無明顯差異,40支煙/天/組的乳鼠體重由正常對照組的5.75±0.35g下降至3.94±0.37g,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=12,p0.001)；(2)10支煙/天/組的左心室舒張末期后壁厚度下降至0.40±0.08mm,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=7,p0.05)；20支煙/天/組的左心室收縮末期前壁厚度、舒張末期后壁厚度和左心室最大重量分別下降至0.68±0.23mm、0.35±0.08mm和11.91±2.87mg,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=8,p0.05)；當(dāng)吸煙的劑量達(dá)到40支煙/天時,左心室舒張末期/收縮末期前壁厚度、左心室舒張末期/收縮末期后壁壁厚度和左心室最大重量分別下降至0.36±0.09mm/0.71±0.16mm、0.37±0.06mm/0.65±0.12mm和11.43±3.89mg,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=13,p0.05)。 (3) Color Doppler結(jié)果顯示,20支煙/天/組和40支煙/天/組乳鼠左、右心室血流呈現(xiàn)分流現(xiàn)象,并且在血流融合處形成綠色的雜色血流,提示室間隔缺損。 (4)HE染色結(jié)果提示,經(jīng)過中等劑量的被動吸煙處理后,乳鼠的心臟室壁厚度變薄。 結(jié)論：孕期持續(xù)高劑量吸煙至分娩,乳鼠體重明顯下降,并且左心室室壁厚度變薄,乳鼠的左右心室血流呈現(xiàn)分流現(xiàn)象,提示室間隔缺損。因此,孕鼠在妊娠期間接受被動吸煙與左心室發(fā)育不良和室間隔缺損等現(xiàn)象相關(guān)。 第二部分吸煙相關(guān)的心臟發(fā)育不良表觀遺傳學(xué)機(jī)制 目的：探討與吸煙相關(guān)的心臟發(fā)育不良的表觀遺傳學(xué)和分子調(diào)控機(jī)制。 方法：于GD8.5、GD13.5和PND1收取大鼠胚胎或乳鼠的心臟組織,于GD8.5檢測各組胚胎的GATA4和C-kit mRNA整體表達(dá)情況；提取GD13.5胚胎心臟RNA進(jìn)行Real-time PCR檢測心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑復(fù)合因子Baf60c、去甲基化酶UTX和心臟特異標(biāo)志物My12的表達(dá)情況；提取PND1的乳鼠心臟組織蛋白進(jìn)行Western-Blot檢測GATA4、Tbx5和My12的表達(dá)量,同時檢測組蛋白H3K27me3的差異情況。 結(jié)果：(1)GD8.5Real-time PCR結(jié)果顯示,40支煙/天/組胚胎心臟C-kit和GATA4mRNA的整體表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢,其中GATA4mRNA的相對表達(dá)量由正常對照組的0.975±0.195下降至0.588±0.330,下調(diào)幅度較大,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.05)；C-kit的mRNA相對表達(dá)量由正常對照組的1.0523±0.111下降至0.760±0.217,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.05)。 (2) GD13.5Real-time PCR結(jié)果顯示,吸煙能夠?qū)е滦呐K轉(zhuǎn)錄因子GATA4mRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)劑量下調(diào)現(xiàn)象,10支煙/天/組、20支煙/天/組和40支煙/天/組胚胎心臟GATA4mRNA相對表達(dá)量由正常對照組的1.104±0.192分別下降為：0.88±0.153、0.825±0.089和0.485±0.181,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6, p0.05; p0.01; p0.001);20支煙/天/組和40支煙/天/組胚胎心臟Baf60c mRNA相對表達(dá)量由正常對照組的1.155±0.166分別下降為：0.67±0.091和0.341±0.191,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.001)。 (3) GD13.5Real-time PCR結(jié)果顯示,10支煙/天/組和20支煙/天/組胚胎心臟Tbx5mRNA相對表達(dá)量反饋上調(diào)至2.449±0.356和2.175±0.248,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.001)；然而,當(dāng)吸煙劑量達(dá)到40支煙/天/組時,Tbx5的mRNA表達(dá)量顯著下降至0.688±0.149,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.001)。 (4) GD13.5Real-time PCR結(jié)果顯示,Nk×2.5mRNA相對表達(dá)量由1.425±0.428反饋上調(diào)至10支煙/天/組和20支煙/天/組的2.551±0.363和2.282±0.446,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.001)；當(dāng)孕鼠吸煙劑量達(dá)到40支煙/天時,心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的mRNA相對表達(dá)量下降至0.861±0.278,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.05)。 (5) GD13.5Real-time PCR結(jié)果顯示,當(dāng)吸煙劑量增加至40支煙/天時,該時期胚胎心臟組織My12mRNA由正常對照組的1.189±0.214下降至0.533±0.163,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.001)。 (6) GD13.5Real-time PCR結(jié)果顯示,10支煙/天/組、20支煙/天/組和40支煙/天/組胚胎心臟UTX mRNA表達(dá)量由正常對照組的1.267±0.411分別下調(diào)至0.928±0.307,0.672±0.096和0.521±0.139,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.05；p0.01；p0.001)；40支煙/天/組胚胎心臟Jmjd3mRNA表達(dá)量由對照組的1.123±0.199,下降至0.600±0.262,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,p0.001)。 (7)PND1的Western-Blot結(jié)果顯示,10支煙/天/組、20支煙/天／組和40支煙/天/組心肌關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA4蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)劑量下調(diào)現(xiàn)象,其中40支煙/天/組GATA4/GAPDH比值由正常對照組的0.654±0.0831,下降至0.455±0.0324,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5,p0.05)。40支煙/天/組Tbx5/GAPDH比值由正常組的0.442±0.0281下降至0.350+0.0624；與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5,p0.05) (8)PND1的Western-Blot結(jié)果顯示,隨著被動吸煙劑量增加至40支煙/天,My12/GAPDH比值由正常對照組的0.298±0.0923下調(diào)至0.164±0.0557,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5,p0.01) (9)PND1的Western-Blot結(jié)果顯示,20支煙/天/組和40支煙/天/組乳鼠心臟組組織H3K27me3/H3比值由正常對照組的0.464±0.103分別上調(diào)至0.893±0.332和1.024±0.150,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=5,p0.01)。 結(jié)論：孕母鼠接受被動吸煙至懷孕中期可致胚胎心臟GATA4、Baf60c和UTX表達(dá)量呈現(xiàn)劑量下調(diào)現(xiàn)象,一方面,UTX的表達(dá)量下調(diào)抑制Baf60c的表達(dá),另一方面,UTX的表達(dá)量下調(diào)導(dǎo)致Tbx5和Nkx2.5與目的基因結(jié)合,從而反饋調(diào)節(jié)Tbx5和Nkx2.5的表達(dá)上調(diào),但當(dāng)吸煙劑量達(dá)到40支煙/天時,Tbx5和Nkx2.5的表達(dá)呈現(xiàn)抑制狀態(tài),以致出生后仍然呈現(xiàn)抑制狀態(tài)。因此,吸煙一方面能夠抑制心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Tbx5和Nkx2.5的表達(dá),另一方面能夠?qū)е耈TX呈現(xiàn)劑量下調(diào)現(xiàn)象,UTX的表達(dá)量下調(diào)能夠抑制Baf60c的表達(dá)和組蛋白的H3K27me3修飾,從而抑制GATA4、Tbx5和Nkx2.5與心臟關(guān)鍵基因My12啟動子結(jié)合,抑制My12的表達(dá),吸煙所致的左心室室壁厚度下降和室間隔缺損很可能與TBU調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常抑制相關(guān)。 第三部分尼古丁對SD大鼠胚胎心臟發(fā)育的影響及分子機(jī)制 目的：研究尼古丁對SD大鼠胚胎心臟發(fā)育的影響并探討其分子機(jī)制。 方法：將懷孕大鼠隨機(jī)分為三組：正常對照組、10mg nicotine/kg/day組和20mgnicotine/kg/day組。于GD0.5分別給予去離子水或濃度為1.0mg/ml和2.0mg/ml的尼古丁溶液灌胃處理,于PND1采用超聲多普勒Vevo2000檢測新生乳鼠的左心室結(jié)構(gòu)及其心臟功能；采用Color-Doppler檢測心室血流方向,以確認(rèn)室間隔的發(fā)育是否異常；采用精密電子天平記錄PND1的新生乳鼠的體重和心臟重量,并計(jì)算心臟重量/體重比值；收取PND1的乳鼠心臟組織,采用Western-Blot的方法觀察各組乳鼠心臟關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GATA4和Tbx5的表達(dá)變化。 結(jié)果：(1)20mg nicotine/kg/day組的心臟重量輕微下降,但與正常對照組相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n=11,p0.05)；10mg nicotine/kg/day組的乳鼠體重由正常對照組的5.49±0.44g上升至6.87±0.67g,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=12,p0.001),20mg nicotine/kg/day組乳鼠體重下降至4.70±0.36g,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=11,p0.01)；心臟重量/體重比值分別為：0.0058±0.00098,0.0049±0.00051,0.0062±0.00087,其中,20mg nicotine/kg/day組心臟重量/體重比值呈現(xiàn)輕微上調(diào),與正常對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=11,p0.05)。 (2)當(dāng)尼古丁的劑量達(dá)到20mg nicotine/kg/天時,左心室舒張末期/收縮末期前壁厚度分別由正常組的0.61±0.19mm和1.03±0.17mm下降至0.44±0.13mm和0.84±0.09mm,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=8,p0.05)左心室舒張末期后壁壁厚度由正常對照組的0.58±0.14mm下降至0.44±0.06mm,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=8,p0.01)；左心室最大重量由正常對照組的24.03±6.73mg下降至11.88±1.81mg,與正常對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=8,p0.01)。 (3) Western-Blot的結(jié)果顯示：當(dāng)尼古丁劑量增加至20mg nicotine/kg/天時,乳鼠心臟組織的GATA4和Tbx5表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢。 結(jié)論：尼古丁對SD乳鼠發(fā)育的影響可表現(xiàn)為體重的增加或下降,與攝取尼古丁的劑量相關(guān)；尼古丁對心臟發(fā)育的影響表現(xiàn)為左心室室壁厚度和左心最大重量的下降,其很可能與GATA4和Tbx5表達(dá)下調(diào)相關(guān)。孕早期吸煙或攝取尼古丁對大鼠胚胎心臟發(fā)育的影響有很大的相似性,因此,香煙中的尼古丁很可能是導(dǎo)致乳鼠心室結(jié)構(gòu)異常發(fā)育的有害化學(xué)物質(zhì)。 全文小結(jié) 1.母鼠孕期吸煙至正常分娩,乳鼠的心臟結(jié)構(gòu)改變?yōu)椋菏冶诤穸群妥笮氖易畲笾亓肯陆担辉衅诒粍游鼰熆蓪?dǎo)致乳鼠室間隔發(fā)育不全。 2.孕期被動吸煙可抑制TBU心臟調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并使基因組啟動子區(qū)域H3K27me3富集,從而影響心臟的發(fā)育。 3.孕鼠在妊娠期間攝取高劑量的尼古丁可導(dǎo)致GATA4和Tbx5的表達(dá)下調(diào),其與心臟異常發(fā)育相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1694761