發(fā)布時(shí)間：2018-03-27 08:10

  本文選題：卵巢癌　切入點(diǎn)：血管生成擬態(tài)　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：卵巢癌(Ovarian Carcinoma, OC)是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率居宮4頸癌和宮體癌之后,在女性生殖道惡性腫瘤中位于第三位。70%患者在就診時(shí)候腫瘤就已為晚期,且多發(fā)生轉(zhuǎn)移,成為女性惡性腫瘤中威脅最大的疾病。血管生成擬態(tài)(Vasculogenic Mimicry,VM)是由腫瘤細(xì)胞自身變形模仿內(nèi)皮細(xì)胞組成的微循環(huán)管道,內(nèi)壁無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞襯覆,為腫瘤組織提供血液循環(huán),從而保持腫瘤組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定從而防止腫瘤內(nèi)部壞死的發(fā)生。VM與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移以及病人預(yù)后密切相關(guān),存在VM的患者生存期短,預(yù)后差。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT)是指上皮源性細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)源性細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象,是VM形成的關(guān)鍵步驟。Wnt5a是EMT發(fā)生的重要信號(hào)通路之一。Wnt5a信號(hào)通路既能活化經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路又能活化非經(jīng)典Wnt通路,并且二者之間相互作用,可能導(dǎo)致Wnt5a在不同腫瘤中生物學(xué)作用并不一致。因此,研究Wnt5a在卵巢癌VM中的作用及其分子機(jī)制有助于豐富和完善腫瘤VM的理論研究。 目的 本研究旨在探討Wnt5a在卵巢癌血管生成擬態(tài)形成中的作用及其可能分子機(jī)制。探討Wnt5a在卵巢癌細(xì)胞EMT發(fā)生和VM形成中的分子機(jī)制有助于豐富和完善VM理論,對(duì)腫瘤血管生成的研究具有重要意義,同時(shí)為臨床上抗腫瘤治療提供了新的思路。 方法 1.首先對(duì)前期實(shí)驗(yàn)收集來(lái)自天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院的79例卵巢癌患者手術(shù)切除且隨訪(fǎng)資料完整的臨床腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行Wnt5a、PKCa和CD44的免疫組織化學(xué)染色。并復(fù)習(xí)前期實(shí)驗(yàn)的CD31/PAS雙染結(jié)果,重點(diǎn)觀察和分析Wnt5a表達(dá)的臨床特征以及Wnt5a與VM、Wnt5a與PKCa、Wnt5a與CD44之間的關(guān)系。 2.根據(jù)卵巢癌細(xì)胞系內(nèi)源性Wnt5a基礎(chǔ)表達(dá)量的水平,分別構(gòu)建穩(wěn)定上調(diào)和穩(wěn)定下調(diào)Wnt5a表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。 3.構(gòu)建體外卵巢癌細(xì)胞三維培養(yǎng)模型,觀察Wnt5a對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外管道化形成能力的影響。 4.構(gòu)建體外卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移模型,觀察Wnt5a對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外侵襲和遷移能力的影響。 5.免疫熒光染色觀察和Western Blotting實(shí)驗(yàn)Wnt5a對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外EMT相關(guān)蛋白的影響。 6. Western Blotting實(shí)驗(yàn)分析Wnt5a對(duì)PKCa和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變情況。 結(jié)果 1. Wnt5a表達(dá)與卵巢癌轉(zhuǎn)移和VM密切相關(guān),是卵巢癌患者一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析Wnt5a和主要臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系,Wnt5a和卵巢癌的轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P=0.008),與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分型和分級(jí)、腹水等臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(P0.05)。Wnt5a陽(yáng)性細(xì).中的VM陽(yáng)性率(15/25,60%)明顯高于Wnt5a陰性組中的VM陽(yáng)性率(8/54,14.8%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。生存分析顯示,Wnt5a陰性表達(dá)患者生存時(shí)間長(zhǎng)于Wnt5a陽(yáng)性表達(dá)患者,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)。 2.卵巢癌組織中Wnt5a的表達(dá)與PKCa的表達(dá)相關(guān)。 79例卵巢癌患者中有35例陽(yáng)性,陽(yáng)性率44.3%(35/79)。Wnt5a陽(yáng)性組的PKCa表達(dá)率(21/25,84%)明顯高于Wnt5a陰性組(14/54,25.9%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 3.卵巢癌組織中Wnt5a的表達(dá)與CD44的表達(dá)相關(guān)。79例卵巢癌患者中有29例陽(yáng)性,陽(yáng)性率36.7%(29/79)。Wnt5a陽(yáng)性組的CD44表達(dá)率(21/25,84%)明顯高于Wnt5a陰性組(8/54,14.8%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。 4. Wnt5a在體外能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系的管道化能力。 高分化的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3形成管道能力較弱,只在邊緣部分形成少量或不完整的管狀結(jié)構(gòu),而低分化的卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3形成管道能力較強(qiáng),形成管狀結(jié)構(gòu)較多且完整,管壁較厚,有多層細(xì)胞組成。上調(diào)Wnt5a后,SKOV3細(xì)胞系形成管道能力明顯增加；下調(diào)Wnt5a后,OVCAR3細(xì)胞系形成管道化能力明顯受到抑制,不能形成完整的管道,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5. Wnt5a能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系EMT發(fā)生。 SKOV3細(xì)胞系上調(diào)Wnt5a后,免疫熒光顯示其間充質(zhì)標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)明顯升高,而上皮標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)明顯降低,下調(diào)OVCAR3細(xì)胞系的Wnt5a表達(dá)后,免疫熒光顯示其間充質(zhì)標(biāo)記分子Vimentin表達(dá)明顯降低,而上皮標(biāo)記分子E-cadherin表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。WB相應(yīng)的檢測(cè)EMT表征性蛋白的改變情況與免疫熒光結(jié)果一致。 6. Wnt5a在體外能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系的侵襲和遷移能力。 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SKOV3轉(zhuǎn)染上調(diào)Wnt5a貢粒后,傷口愈合趨勢(shì)明顯升高；Ovcar3轉(zhuǎn)染下調(diào)Wnt5a質(zhì)粒后,傷口愈合趨勢(shì)明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,OVCAR3細(xì)胞系經(jīng)過(guò)下調(diào)Wnt5a之后,穿透能力明顯降低;SKOV3細(xì)胞系經(jīng)過(guò)上調(diào)Wnt5a處理之后,穿透能力明顯高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 7. Wnt5a通過(guò)PKCa言號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT,形成VM,PI3K和Snail、MMP-2等調(diào)控因子發(fā)揮重要作用。 WB檢測(cè)顯示,將OVCAR3細(xì)胞系下調(diào)Wnt5a后PKCa表達(dá)明顯降低,而將SKOV3細(xì)胞系上調(diào)Wnt5a后PKCa的表達(dá)明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入PKCa抑制劑后,SKOV3-pWnt5a細(xì)胞系的遷移能力明顯下降,提示PKCa在Wnt5a通路中起重要作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 OVCAR3細(xì)胞系下調(diào)Wnt5a之后,PI3K和Snail、MMP-2表達(dá)水平顯著降低,加入PKCa激活劑(PMA)之后,二者的表達(dá)水平明顯升高；SKOV3細(xì)胞系上調(diào)Wnt5a之后,PI3K和Snail、MMP-2表達(dá)水平顯著升高,但加入PKCa抑制劑之后,二者的表達(dá)水平則明顯降低,但β-catenin的表達(dá)水平無(wú)明顯差異。 結(jié)論 1. Wnt5a表達(dá)與卵巢癌患者的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)：Wnt5a高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后差刁Wnt5a氐表達(dá)的卵巢癌患者,Wnt5a可以作為卵巢癌患者預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)。 2. Wnt5a能通過(guò)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞系發(fā)生EMT,進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞VM的形成,并能促進(jìn)其遷移和侵襲能力,在卵巢癌演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。 3. PKCa在Wnt5a信號(hào)通路中起重要作用：Wnt5a主要通過(guò)PKCa信號(hào)通路而不是β-catenin信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞EMT發(fā)生,Snail、PI3K、MMP-2是重要調(diào)節(jié)因子 4.卵巢癌干細(xì)胞特性在VM形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用,Wnt5a能促進(jìn)卵巢癌干細(xì)胞表型的表達(dá),為VM形成提供生物學(xué)基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1670711