本文選題：上皮性卵巢癌　切入點：氧化苦參堿　出處：《河北醫(yī)科大學》2015年博士論文

【摘要】：目的:上皮性卵巢癌是婦科生殖道腫瘤中致死率最高的一種惡性腫瘤,據(jù)統(tǒng)計2015年美國將有21290例新發(fā)病例和14180例死亡病例。該病起病隱匿,初診者中70%已屬晚期,從而失去最佳手術(shù)時機。即使能手術(shù),術(shù)后也極易復發(fā)。即使手術(shù)徹底,肉眼見不到的腫瘤結(jié)節(jié)和數(shù)量不等的癌細胞仍然會有殘留,如不及時治療,殘留的癌細胞將成幾何級數(shù)增長,更何況晚期卵巢癌病變多已累及盆腔內(nèi)的許多臟器造成致密的癌性粘連,尤其是重要臟器如肝臟的轉(zhuǎn)移或腸系膜根部的轉(zhuǎn)移等,手術(shù)不能徹底切除病灶,手術(shù)更不能解決遠處轉(zhuǎn)移,因此化療已成為卵巢癌根治的一部分,患者的預后在很大程度上取決于對化療的敏感性。近半個多世紀以來,化療藥也歷經(jīng)變遷,上世紀中期主要采用烷化劑及抗代謝藥物治療,1970s年代后期單藥順鉑開始應用于臨床,1982年美國M.D.Anderson Cancer Center開始應用PAC(順鉑、阿霉素、環(huán)磷酰胺)方案。聯(lián)合方案較單一順鉑方案使患者的生存率提高了15%。1990年初,紫杉醇問世,1996年GOG111經(jīng)研究宣布TP(紫杉醇、順鉑)方案優(yōu)于PC方案。1999年,GOG證實紫杉醇與卡鉑聯(lián)合聯(lián)合化療的毒副作用較紫杉醇與順鉑聯(lián)合作用輕,兩者的療效無顯著區(qū)別。2011年將抗血管生成藥物貝伐單抗(bevacizumab)引入臨床。卵巢癌是對化療藥高度敏感的腫瘤,隨著化療藥物的每一次進步,卵巢癌患者的5年生存率不斷得到提高。盡管卵巢癌對化療藥高度敏感,且大部分患者在治療初期都能得到緩解,但多數(shù)患者都會復發(fā),一般平均復發(fā)時間在18個月�；颊咦罱K會出現(xiàn)耐藥,最后死于無藥可治。由于化療是卵巢癌中重要的不可缺少的治療手段,故針對卵巢癌的致癌靶點,研發(fā)新的抗腫瘤藥物是解決卵巢癌治療問題的重要途徑。Micro RNAs(mi RNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的高度保守的具有調(diào)控功能非編碼小RNAs,其長度為19-25個核苷酸,通過在轉(zhuǎn)錄后水平靶向作用于m RNAs降解靶m RNA或者阻遏靶m RNA的翻譯。目前已發(fā)現(xiàn)其成員超過1000個,調(diào)控至少30%以上的基因表達。一個mi RNAs可以作用于多個m RNAs,很多編碼蛋白質(zhì)的基因都受其調(diào)控。而幾個mi RNAs也可以調(diào)節(jié)同一個m RNA。mi RNAs在調(diào)節(jié)基因表達中起重要作用。一旦mi RNA表達失衡將可能導致疾病的發(fā)生。mi RNA表達的變化可以引起多個m RNAs表達譜的改變,繼而引起細胞功能的變化。已有多項研究表明,mi RNA是許多生理過程的主要調(diào)控者,參與胚胎發(fā)育、器官形成,以及細胞的增殖、分化、細胞周期進程及凋亡等。其異常表達常與許多疾病包括癌癥的發(fā)生有關(guān)。在腫瘤中,mi RNAs常常發(fā)生擴增或缺失,導致腫瘤抑制蛋白的表達減少或癌蛋白的過度表達。許多mi RNA位于基因組的脆性位點或腫瘤相關(guān)區(qū)域,如染色體斷裂點的區(qū)域、發(fā)生雜合性缺失的區(qū)域、以及發(fā)生擴增和重排的區(qū)域等。因此,特定mi RNA的表達異常與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。其中mi RNA125b(mi R-125b)在癌癥研究領(lǐng)域引起了學者們的關(guān)注。成熟的mi R-125b由mi R-125b-1和mi R-125b-2兩個基因產(chǎn)生,這兩個基因都位于染色體的脆性部位,在乳腺癌、卵巢癌和宮頸癌中常發(fā)生缺失。全基因組mi RNA表達譜分析表明mi R-125b在卵巢癌中是異常表達的。已有研究表明在裸鼠中mi R-125b的過表達可以降低人卵巢癌細胞的增殖,抑制卵巢癌細胞的生長,mi R-125b的降調(diào)與卵巢癌細胞的侵襲增強和不良預后有關(guān)。這說明mi R-125b的異常表達在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用,但其下游靶基因及詳細作用機制尚待闡明。我們應用生物信息學工具Pictar(http://pictar.Bio.nyu.edu/),Targetscan(http//www.targetscan.org/),以及Mi Randa(http://www.Microma.org/)等對mi R-125b的可能靶基因進行了預測,預測結(jié)果顯示:STAT3(The transcription factor signal transducer and activator of transcription 3)編碼區(qū)存在mi R-125b的作用靶點,因此STAT3很可能是mi R-125b的下游靶基因,但調(diào)控作用尚需進一步驗證。信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT)家族是潛在的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子,在細胞中既能傳遞胞漿信號又起到啟動核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的功能。其中STAT3(The transcription factor signal transducer and activator of transcription 3)信號轉(zhuǎn)導通路直接影響細胞的增殖、分化及凋亡過程。在正常情況下,STAT3蛋白的激活是快速的、短暫的。該通路異常活化可導致細胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。在人類許多類型的腫瘤中,均有其異常的持續(xù)激活和高表達,從而通過c-myc、cyclin D1、survivin和Bcl家族等途徑促進細胞增殖,抑制細胞凋亡。許多癌癥細胞株和原發(fā)腫瘤包括卵巢癌中都報道有持續(xù)激活的STAT3(p STAT3),導致細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)分子式C15H24N2O2,分子量為264.36,是傳統(tǒng)中藥苦參的有效成分,屬于四環(huán)喹諾里西啶類(quinol-izidine)生物堿,性寒味苦,有清熱解毒,明目止淚,燥濕利尿,祛風殺蟲,安五臟,轉(zhuǎn)身定志等作用�，F(xiàn)代醫(yī)學證明其具有較好的抗腫瘤活性,還具有抗炎、抗病毒、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。近年來其抗腫瘤活性引起了學者們的關(guān)注。體外實驗表明氧化苦參堿能抑制腫瘤細胞增殖、誘導周期阻滯、促進細胞凋亡、誘導腫瘤細胞分化、抗腫瘤新生血管形成以及抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移,對多種腫瘤細胞具有殺傷或抑制作用。目前其針對肝癌細胞、白血病細胞的研究較為廣泛,對腸癌、宮頸癌、卵巢癌的研究也有報道,但多停留于表象,缺乏對其分子機制的深入研究。卵巢癌是一種異質(zhì)性疾病,其病理類型較為復雜。其中上皮性卵巢癌占原發(fā)卵巢腫瘤的90%,主要分為漿液性、粘液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細胞、移行細胞、混合性和未分化癌。漿液性卵巢癌占卵巢癌的75%。不同亞型的卵巢癌具有不同的分子改變及不同的生物學特性,對藥物反應也不盡相同。在本實驗中我們選取常見的漿液性卵巢癌細胞株SKOV3,觀察OMT能否抑制其增殖及侵襲,并探討其作用的分子機制是否通過mi R-125b-STAT3途徑。mi R-125b-STAT3方法:1選取FIGO III期漿液性卵巢癌組織標本5例,取正常卵巢組織為對照,采用RT-PCR法分別測定兩種組織中mi R-125b及STAT3m RNA的表達,用Western blot測定兩種組織中STAT3的蛋白表達水平,初步探討mi R-125b及STAT3分別在漿液性卵巢癌組織與正常卵巢組織中表達的差異性。2為研究OMT應用于卵巢癌治療的可行性,本研究在細胞水平探討OMT對SKOV3細胞增殖、侵襲能力的影響,選取不同濃度OMT作用于SKOV3細胞不同時間后,采用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測OMT對SKOV3細胞生長的影響;采用Transwell小室檢測OMT對SKOV3細胞侵襲能力的影響。3不同濃度的OMT作用于SKOV3細胞后,采用RT-PCR及Western blot方法檢測細胞中VEGF、cyclin D1、p21、p27以及MMP2/MMP9表達情況的變化,探討OMT對SKOV3細胞增殖與侵襲能力影響的的分子機制。4為進一步研究OMT對SKOV3細胞增殖與侵襲能力影響的作用機制,本實驗采用了RT-PCR及Western blot方法分別檢測不同濃度OMT作用于SKOV3細胞后mi R-125b的表達情況以及STAT3 m RNA、蛋白的表達情況。5分別將mi R-125b-mimic、anti-mi R-125b轉(zhuǎn)染至SKOV3細胞中,檢測相應的STAT3 m RNA、蛋白的變化及對SKOV3細胞增殖與侵襲能力的影響。結(jié)果:1 RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果均提示,漿液性卵巢癌組織中mi R-125b的表達水平明顯低于正常卵巢組織,而STAT3的表達水平明顯高于正常卵巢組織。2不同濃度OMT作用于SKOV3細胞不同時間后,OMT組SKOV3細胞的OD值均較對照組明顯減低,且表現(xiàn)出時間濃度依賴性。同時,Transwell小室實驗結(jié)果顯示,不同濃度OMT作用于SKOV3細胞不同時間后,OMT組的穿膜細胞數(shù)均明顯少于對照組。3不同濃度的OMT作用于SKOV3細胞后,VEGF、cyclin D1的表達水平均低于對照組,且隨著OMT濃度的升高,VEGF、cyclin D1的表達逐漸降低,呈現(xiàn)濃度依賴性。不同濃度的OMT作用于SKOV3細胞后,p21、p27的表達水平均高于對照組,且隨著OMT濃度的升高,p21、p27的表達逐漸升高,呈現(xiàn)濃度依賴性。不同濃度的OMT作用于SKOV3細胞后,MMP2,MMP9的表達水平均低于對照組,且隨著OMT濃度的升高,MMP2,MMP9的表達逐漸降低,呈現(xiàn)濃度依賴性。4不同濃度的OMT作用于SKOV3細胞后,mi R-125b的表達均較對照組明顯升高,且隨著OMT濃度的增高,mi R-125b的表達逐漸升高;而STAT3 m RNA的表達均較對照組明顯降低,且隨著OMT濃度的增高,STAT3 m RNA的表達逐漸降低,與mi R-125b呈現(xiàn)反向變化。Western blot結(jié)果顯示,不同濃度的OMT作用于SKOV3細胞后,STAT3蛋白的表達均明顯低于對照組,與以上PCR結(jié)果相一致,隨著OMT濃度的增高,STAT3蛋白的表達逐漸降低,呈現(xiàn)濃度依賴性。5當SKOV3細胞成功轉(zhuǎn)染mi R-125b-mimic后,STAT3 m RNA及蛋白的表達均較對照組明顯降低。采用MTT法檢測mi R-125b-mimic組與對照組SKOV3細胞的OD值變化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),mi R-125b-mimic組的OD值均明顯低于對照組;同時,Transwell小室實驗結(jié)果表明mi R-125b-mimic組SKOV3細胞的穿膜細胞數(shù)顯著少于對照組。然而,在轉(zhuǎn)染anti-mi R-125b的SKOV3細胞中,STAT3m RNA及蛋白的表達均較對照組明顯升高。MTT實驗顯示anti-mi R-125b組SKOV3細胞的OD值明顯高于對照組,Transwell小室結(jié)果顯示,anti-mi R-125b組SKOV3細胞的跨膜數(shù)明顯高于對照組。推測OMT可能通過mi R-125b影響SKOV3細胞的增殖、侵襲能力。OMT mi R-125b結(jié)論:1氧化苦參堿對卵巢癌SKOV3細胞的增殖及侵襲具有抑制作用。2氧化苦參堿可能是通過mi R-125b-STAT3途徑調(diào)控STAT3相關(guān)的增殖基因VEGF、cylclin D1、p21、p27及STAT3相關(guān)的侵襲基因MMP2、MMP9的來抑制SKOV3細胞的增殖和侵襲能力。3 mi R-125b-STAT3可作為卵巢漿液性癌的治療靶點,氧化苦參堿可做為治療卵巢漿液性癌的候選新藥。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 史蔚;萬小平;;微小RNA在卵巢癌中的研究進展[J];國際婦產(chǎn)科學雜志;2010年01期

2 諶科;胡志全;王濤;郭輝;葉章群;;Inhibitory Effect of Matrine on the Expression of PSA and AR in Prostate Cancer Cell line LNCaP[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2008年06期

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本文編號：1663102