發(fā)布時(shí)間：2018-03-20 16:36

  本文選題：子宮肌瘤　切入點(diǎn)：myosin　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景子宮肌瘤(Uteruine Myoma)是女性生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤,臨床發(fā)病率高達(dá)20%-40%,其主要臨床癥狀包括生殖道出血、不孕、流產(chǎn)及貧血,給患者帶來(lái)了巨大的痛苦并嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量。子宮肌瘤主要是由子宮平滑肌細(xì)胞增生而成,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,較傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為子宮肌瘤是由于性激素(主要是雌性激素)及局部生長(zhǎng)因子間較為復(fù)雜的相互作用,導(dǎo)致子宮平滑肌細(xì)胞異常增生的結(jié)果。然而,隨著近年來(lái)研究的逐漸深入,子宮肌瘤患者子宮平滑肌細(xì)胞存在的異常收縮現(xiàn)象表明,肌球蛋白(Myosin)的功能異�？赡茉谧訉m肌瘤發(fā)病中起到了重要作用。作為肌原纖維粗絲的組成單位,肌球蛋白存在于平滑肌細(xì)胞中,在肌肉運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要功能,因此,myosin的功能異常與子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制間的相關(guān)性就成為本課題的研究重點(diǎn)。 平滑肌細(xì)胞以“肌絲滑動(dòng)”原理進(jìn)行收縮,其每個(gè)收縮單位是由粗肌絲(肌球蛋白)和細(xì)肌絲(肌動(dòng)蛋白)組成,當(dāng)平滑肌細(xì)胞收縮時(shí),粗細(xì)肌絲相互重疊,肌原纖維成螺旋形扭曲而使平滑肌細(xì)胞變短增粗。Myosin是粗肌絲的基本組成蛋白,大約由200-250個(gè)分子聚集而成,形成長(zhǎng)約1.5μm的粗絲；同時(shí)myosin也是各類肌細(xì)胞中含量最多的結(jié)構(gòu)蛋白和收縮蛋白,約占其總蛋白庫(kù)的25%,因此,myosin在肌肉收縮的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。myosin是一個(gè)六聚體的大分子蛋白質(zhì),由兩條Mr約為220,000的重鏈(Myosin Heavy Chain, MHC)和幾條Mr約為16,000-27,000的輕鏈(Myosin Light Chain, MLC)組成,每條重鏈包括一個(gè)完整的球狀頭部(N-末端)及一個(gè)長(zhǎng)的纖維狀a-螺旋尾部(C-末端)；幾條MHC大部分以雙股α-螺旋盤繞,形成長(zhǎng)約1500埃的長(zhǎng)棒狀,其余部分則和MLC一起構(gòu)成球形頭部；被激活后,myosin成為有活性并能分解ATP的ATP酶。 與此同時(shí),目前至少發(fā)現(xiàn)了18種肌球蛋白亞型,它們的結(jié)構(gòu)和功能各不相同,共同組成了肌球蛋白超家族蛋白質(zhì),因此,作為一種多功能蛋白質(zhì),myosin在生物體內(nèi)發(fā)揮了許多重要功能。近年來(lái)的研究表明,myosin的表達(dá)與功能異常與平滑肌細(xì)胞異常增殖、侵襲和形態(tài)功能紊亂密切相關(guān)；與此同時(shí),腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移所需要的細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度分泌也與myosin的功能紊亂密切相關(guān)。 子宮肌瘤細(xì)胞外過(guò)量基質(zhì)的產(chǎn)生和沉積是由肌瘤細(xì)胞自身合成并分泌,這些分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的生物大分子,主要是由一些多糖、蛋白或蛋白聚糖組成,它們構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架結(jié)構(gòu),支持并連接細(xì)胞結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理活動(dòng),其中細(xì)胞與基質(zhì)的粘附是多種蛋白共同跨膜傳導(dǎo)細(xì)胞力的結(jié)果,這些分子可以根據(jù)細(xì)胞的化學(xué)及機(jī)械環(huán)境來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生化信號(hào),因此,細(xì)胞粘附的形成是由多方面因素來(lái)調(diào)節(jié)的,包括肌動(dòng)蛋白的形成、細(xì)胞內(nèi)myosin的激活及myosin與細(xì)胞外基質(zhì)形成的細(xì)胞外力。這種包含了力、信號(hào)及機(jī)械傳感的協(xié)同作用共同決定了整個(gè)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)和疾病發(fā)生發(fā)展歷程中的細(xì)胞表型變化。因此,myosin不僅參與肌肉運(yùn)動(dòng),為肌肉收縮提供動(dòng)力,其作為細(xì)胞骨架的組成成分,同時(shí)參與細(xì)胞外基質(zhì)成分的相互作用并調(diào)控細(xì)胞的增殖及侵襲過(guò)程。在子宮肌瘤患者的子宮肌瘤組織中存在著大量排列和分布紊亂的平滑肌細(xì)胞和過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì),因此,nyosin的異常是否影響子宮平滑肌細(xì)胞的異常增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的積聚,從而進(jìn)一步加劇子宮肌瘤的發(fā)病成為本課題的重要研究?jī)?nèi)容。 Myosin可能成為平滑肌細(xì)胞收縮通路及增殖通路的中間交叉點(diǎn),啟發(fā)我們對(duì)子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行更加深入的思考。目前有關(guān)myosin在子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制中的作用尚無(wú)深入研究,本課題分兩部分探討myosin在子宮肌瘤中的表達(dá),及在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。 第一部分Myosin在子宮肌瘤組織中的表達(dá) 研究目的通過(guò)檢測(cè)子宮肌瘤和正常子宮平滑肌組織中]myosin各組成成分：肌球蛋白輕鏈(MLC)、肌球蛋白重鏈(MHC)及肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light chain kinase,MLCK)在蛋白和mRNA水平的表達(dá),對(duì)比子宮肌瘤組織和正常子宮平滑肌組織中上述三種分子的表達(dá)差異,觀察myosin在子宮肌瘤組織中是否存在表達(dá)異常,為進(jìn)一步探討myosin在子宮肌瘤發(fā)病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。 研究方法1.采用免疫組織細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)30例子宮肌瘤病人肌瘤組織及30例子宮平滑肌組織中MLC、MHC、MLCK及p-MLCK的表達(dá),比較子宮肌瘤組織及子宮平滑肌組織中上述指標(biāo)的表達(dá)差異。2.采用Real-Time PCR法檢測(cè)30例子宮肌瘤組織及30例子宮平滑肌組織中MLC、MHC、MLCK及p-MLCK mRNA水平的表達(dá),并比較子宮肌瘤組織及子宮平滑肌組織中以上指標(biāo)的表達(dá)差異。3.采用Western blot法檢測(cè)30例子宮肌瘤組織及30例子宮平滑肌組織中MLC、MHC、 MLCK及p-MLCK蛋白含量,比較子宮肌瘤組織及子宮平滑肌組織中以上指標(biāo)的表達(dá)差異。 研究結(jié)果1.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,子宮肌瘤細(xì)胞形態(tài)與子宮平滑肌細(xì)胞相似,但肌瘤細(xì)胞排列比較密集且較為紊亂。免疫組織化學(xué)切片染色中出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果,染色越深表示表達(dá)量越高。子宮肌瘤組織與子宮平滑肌組織相比,MLC、MHC、MLCK及p-MLCK均呈高表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2. Real-Time PCR法檢測(cè)子宮肌瘤組織中MLC、MHC和MLCK的表達(dá),子宮肌瘤組織與子宮平滑肌組織相比,MLC、MHC及MLCK在mRNA水平的表達(dá)均上調(diào),兩者比較有顯著差異(P0.05)。3.應(yīng)用Western Blot法在子宮肌瘤及子宮平滑肌組織中均檢測(cè)到MLC、MHC、MLCK及p-MLCK相應(yīng)的蛋白特異性條帶,但子宮肌瘤組織中的ML、MHC、MLCK及p-MLCK相對(duì)含量顯著高于子宮平滑肌組織,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 研究結(jié)論在子宮肌瘤組織中,MLC、MHC、MLCK及p-MLCK均呈高表達(dá),其中MHC在子宮肌瘤組織中的表達(dá)變化最為顯著。上述結(jié)果提示我們,myosin個(gè)組成成分的表達(dá)異常可能與子宮肌瘤的發(fā)病具有相關(guān)性。 研究意義本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化、Real-Time PCR及R Western Blot的方法證實(shí)了myosin及其上游的MLCK在肌瘤組織中存在表達(dá)異常,MLC、MHC、MLCK及p-MLCK的表達(dá)變化能夠引起平滑肌細(xì)胞排列及收縮功能紊亂,而子宮平滑肌細(xì)胞的功能紊亂與子宮肌瘤的發(fā)生存在一定的相關(guān)性,同時(shí)上述研究結(jié)果為進(jìn)一步研究myosin的功異常在子宮平滑肌細(xì)胞促增殖及促細(xì)胞外基質(zhì)分泌中的作用奠定了基礎(chǔ)。 第二部分MHC在調(diào)控子宮肌瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞外分泌中的作用 研究目的觀察MHC的表達(dá)異常對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖紊亂及細(xì)胞外分泌功能異常的影響。 研究方法運(yùn)用RNAi技術(shù),敲降編碼MHC蛋白的MYH11基因,干擾myosin重鏈MHC的表達(dá),觀察MHC表達(dá)下調(diào)對(duì)子宮肌瘤平滑肌細(xì)胞增殖及細(xì)胞外分泌功能的影響。我們通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白,觀察MHC與細(xì)胞增殖的關(guān)系；通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,觀察MHC在調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)分泌中的作用,從而進(jìn)一步了解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)變化在MHC相關(guān)的細(xì)胞增殖中的作用。1.采用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)子宮肌瘤細(xì)胞。2.制備含有MYH11siRNA的慢病毒。3.將制備好的慢病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人子宮肌瘤細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后72h用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞比率。根據(jù)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)表達(dá)后發(fā)綠色熒光的特點(diǎn),在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。4.采用RT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染含有MYH11siRNA的慢病毒后子宮肌瘤細(xì)胞與對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞中MHC的mRNA水平,檢測(cè)干擾效率。5.采用MTT法檢測(cè)MYH11RNAi后子宮肌瘤細(xì)胞及對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞的增殖情況,分析MYH11RNAi對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力的影響。6.Western-blot法檢測(cè)MYH11RNAi前后子宮肌瘤細(xì)胞中增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、P53及絲氨酸／蘇氨酸激酶AKT的表達(dá)變化,進(jìn)一步觀察MHC表達(dá)缺失對(duì)肌瘤細(xì)胞增殖的影響。7.Real-Time PCR法檢測(cè)MYH11RNAi前后子宮肌瘤細(xì)胞組和對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞中膠原蛋白I、IGF-1、纖連蛋白、EGF及蛋白多糖mRNA的表達(dá),分析MHC表達(dá)下調(diào)對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞膠原蛋白I、IGF-1、纖連蛋白、EGF及蛋白多糖mRNA表達(dá)的影響。8. ELISA法檢測(cè)MYH11RNAi后子宮肌瘤細(xì)胞和對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞中膠原蛋白Ⅰ、IGF-1、纖連蛋白、EGF及蛋白多糖的表達(dá),分析MHC表達(dá)下調(diào)對(duì)于肌瘤細(xì)胞膠原蛋白Ⅰ、IGF、纖連蛋白、EGF及蛋白多糖表達(dá)的影響。 研究結(jié)果1.體外培養(yǎng)的子宮肌瘤細(xì)胞在顯微鏡下觀察細(xì)胞呈梭形,狀態(tài)良好。2.轉(zhuǎn)染含有MYH11siRNA的慢病毒成功的子宮肌瘤細(xì)胞在顯微鏡下可以觀察到綠色熒光,通過(guò)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)感染效率大于70%。3RT-PCR方法檢測(cè)子宮肌瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染含有MYH11siRNA的慢病毒72h后,MHC的mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比下降約72%,因此我們認(rèn)為已成功下調(diào)MHC的表達(dá)。4.MTT法檢測(cè)子宮肌瘤細(xì)胞的增殖結(jié)果顯示,在轉(zhuǎn)染后72h, MYH11RNAi組子宮肌瘤細(xì)胞增殖效率與對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞組相比明顯下降,差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5. Western-blot結(jié)果顯示,MYH11RNAi組子宮肌瘤細(xì)胞中PCNA、 p-AKT及AKT的表達(dá)均較對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞中降低,而P53的表達(dá)則是MYH11RNAi組高于對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞,各組之間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。6.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,干擾MYH11的表達(dá)降低了子宮肌瘤細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)(P0.05)；干擾組子宮肌瘤細(xì)胞中IGF-Ⅰ的表達(dá)也較對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞明顯減少(P0.05)；干擾組纖連蛋白表達(dá)較對(duì)照組子宮肌瘤肌瘤細(xì)胞明顯下降(P0.05)；而干擾MYH11的表達(dá)使得子宮肌瘤細(xì)胞中EGF的表達(dá)較對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞明顯升高(P0.05)；蛋白聚糖的表達(dá)在干擾組與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P0.05)。7.ELISA法檢測(cè)MYH11RNAi24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后子宮肌瘤細(xì)胞中膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)維持在較為穩(wěn)定的水平,而對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)膠原蛋白Ⅰ的表達(dá)逐漸升高,故干擾組膠原蛋白Ⅰ的含量在轉(zhuǎn)染24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)明顯低于對(duì)照組,兩者比較差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); MYH11RNAi24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后子宮肌瘤細(xì)胞中IGF-1的含量均較低,而對(duì)照組中IGF-1在24小時(shí)及48小時(shí)的表達(dá)水平較高,72小時(shí)下降,但總體而言干擾組IGF-1的含量均低于對(duì)照組,兩者比較差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); MYH11RNAi24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后子宮肌瘤細(xì)胞中纖連蛋白的含量及對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞的含量均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,但干擾組均低于對(duì)照組,兩者比較差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); MYH11RNAi24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后子宮肌瘤細(xì)胞及對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞中EGF的含量均逐漸升高,干擾24小時(shí)及72小時(shí)比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；MYH11RNAi24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)后子宮肌瘤細(xì)胞中蛋白多糖的含量逐漸升高,對(duì)照組子宮肌瘤細(xì)胞蛋白多糖的含量也逐漸增加,干擾組與對(duì)照組相比,無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 研究結(jié)論MHC的表達(dá)變化能夠影響子宮肌瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白的分泌,其中PCNA、AKT、膠原蛋白I、IGF-1及纖連蛋白的表達(dá)隨著MHC表達(dá)的下調(diào)而明顯下降,P53和EGF則明顯升高,蛋白多糖的含量并無(wú)顯著變化。 研究意義通過(guò)本實(shí)驗(yàn),我們干擾了MHC的表達(dá),直接破壞了myosin的結(jié)構(gòu)及活性后,發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤細(xì)胞增殖能力明顯下降；另外,部分細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及細(xì)胞因子的分泌發(fā)生異常,這些蛋白的表達(dá)變化可能直接或間接改變平滑肌細(xì)胞的生理特性及細(xì)胞周圍微環(huán)境。因此,我們推測(cè)nyosin不僅在子宮平滑肌細(xì)胞的收縮功能發(fā)揮了重要作用,MHC的表達(dá)變化對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的分泌等方面都產(chǎn)生了一定影響,從而啟發(fā)我們對(duì)子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行更加深入的研究和探討。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.33

【共引文獻(xiàn)】

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