本文選題：轉(zhuǎn)化生長因子β1　切入點：p38絲裂素活化蛋白激酶　出處：《承德醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：絨毛膜癌是一種高度惡性滋養(yǎng)細胞腫瘤，起源于培養(yǎng)滋養(yǎng)層，可能發(fā)生于流產(chǎn)之后，或異位妊娠過程中。絨癌可通過靜脈和淋巴系統(tǒng)廣泛地轉(zhuǎn)移到其他器官或組織中。早期血液和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致患者迅速死亡。近年來轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)成為腫瘤研究的熱點因子之一，并且它在絨癌的發(fā)生和發(fā)展中是一個關(guān)鍵因素。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）是一種具有多生物學(xué)活性功能的多肽類細胞因子，TGFβ至少有5種異構(gòu)體（TGF-β1～5），其中TGF-β1是主要存在形式，幾乎所有的細胞都能分泌TGF-β1。它可以調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、促進細胞外基質(zhì)(ECM)形成，參與胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)等，并且其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TGFβ/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由細胞膜表面的TGFβ受體及其下游胞質(zhì)內(nèi)Smad蛋白家族組成。TGFβ首先識別并與細胞膜表面的受體結(jié)合，受體復(fù)合物再激活其下游的蛋白smad2、3，使其磷酸化。被激活的smad2、3與Smad4結(jié)合，，形成復(fù)合物，然后進入細胞核與核內(nèi)的各類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。近年來p38絲裂素活化蛋白激酶（p38mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的研究中也成為熱點之一，并且有報道顯示TGFβ可激活p38MAPK通路，在胃癌和大鼠心肌成纖維細胞中兩個通路有交互作用，但在絨毛膜癌中TGFβ與p38MAPK通路相互作用的關(guān)鍵位點及其機制尚不明確，因此本實驗擬應(yīng)用TGF-β1受體阻滯劑及p38MAPK抑制因子對被TGF-β1刺激活化的絨癌JEG-3細胞進行干預(yù)，對兩條通路的下游蛋白進行檢測以揭示兩條信號通路在絨毛膜癌中交互作用的位點和作用機制。 目的： 探討TGF-β1介導(dǎo)的Smad3與p38MAPK在絨癌JEG-3細胞中的串話作用。 方法： 1.人絨癌細胞系JEG-3生長在含10%的胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，1mmol/L丙酮酸鈉，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3d換液一次。當(dāng)細胞長至70-80%左右時用0.02%EDTA和0.25%胰酶消化液按1:3的比例進行傳代。 2.JEG-3細胞以初始濃度為5×104個/mL接種于24孔板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換以無血清的RPMI-1640饑餓培養(yǎng)12h。將細胞分為空白對照組，2h TGF-β1刺激組，6h TGF-β1刺激組。培養(yǎng)終止前2h和6h分別給予不同組細胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白對照組除外。每組設(shè)置3個復(fù)孔，用免疫熒光染色法對P-Smad的表達及核轉(zhuǎn)位情況進行檢測。 3. JEG-3細胞以初始濃度為5×104個/mL接種于6孔板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換以無血清的RPMI-1640饑餓培養(yǎng)12h。將細胞分組設(shè)置為6個組，分別為：空白對照組，TGF-β1刺激組，p38抑制劑（SB203580）1μM組，p38抑制劑（SB203580）3μM組， TGF-β1受體阻滯劑（LY364947）1μM組，TGF-β1受體阻滯劑（LY364947）3μM組。培養(yǎng)終止前4h分別給予各抑制劑組細胞相應(yīng)濃度的TGF-β1受體阻滯劑（LY364947）及p38抑制劑（SB203580）。在終止培養(yǎng)前2h，給予各組細胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白對照組除外。用免疫印跡法檢測各組細胞中Smad3以及P-Smad3的蛋白表達水平。 4. JEG-3細胞以初始濃度為5×104個/mL接種于6孔板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換以無血清的RPMI-1640饑餓培養(yǎng)12h。將細胞分組設(shè)置為6個組，分組情況如上所述。培養(yǎng)終止前4h分別給予各抑制劑組細胞相應(yīng)濃度的TGF-β1受體阻滯劑（LY364947）及p38抑制因子（SB203580）。在終止培養(yǎng)前2h，給予各組細胞5ng/ml的TGF-β1刺激，空白對照組除外。用實時定量PCR法檢測smad3的mRNA表達水平。 結(jié)果： 1.在對照組中，P-Smad的表達成云霧狀主要呈現(xiàn)在胞漿中，少量表達在細胞核。TGF-β1給予2h后，P-Smad3呈現(xiàn)胞漿胞核均表達。在TGF-β1給予6h后，P-Smad3主要表達在胞核，即TGF-β1給予6h，P-Smad3基本完成了由胞漿到胞核的核轉(zhuǎn)位過程。 2．與空白對照組相比，TGF-β1刺激組的Smad3，P-Smad3蛋白表達增高(P0.05)，而TGF-β1受體阻滯劑（LY364947）1μM組，TGF-β1受體阻滯劑（LY364947）3μM組中隨TGF-β1受體阻滯劑濃度的升高，Smad3，P-Smad3的蛋白表達呈濃度依賴性降低(P0.05)。與TGF-β1刺激組相比，p38抑制劑（SB203580）1μM組，p38抑制劑（SB203580）3μM組中隨著抑制因子濃度的升高，Smad3，P-Smad3蛋白的表達亦呈濃度依賴性降低(P0.05)。 3.與對照組相比，TGF-β1刺激組中的Smad3的mRNA表達水平顯著升高(P0.05)。與其TGF-β1刺激組相比，隨著抑制劑濃度的升高，TGF-β1受體阻滯劑組和p38抑制劑組中Smad3的轉(zhuǎn)錄表達水平逐漸降低(P0.05)。 結(jié)論： 1. TGF-β1可激活Smad3，并促使磷酸化的Smad3進行核轉(zhuǎn)位。 2.阻滯了P38MAPK通路，TGFβ介導(dǎo)的Smad3，P-Smad3蛋白表達均降低，且成濃度依賴性。 3.阻滯了P38MAPK通路，TGF-β1介導(dǎo)的Smad3的轉(zhuǎn)錄水平降低，且成濃度依賴性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：承德醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

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本文編號：1618435