本文選題：糖皮質(zhì)激素　切入點：卵巢癌　出處：《第二軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、研究背景和目的轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特點之一,也是造成腫瘤患者死亡的主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜,包括腫瘤細胞從原位腫瘤脫落,脫落的腫瘤細胞與基質(zhì)黏附、釋放基質(zhì)水解酶破壞和穿過基底膜,侵襲血管和淋巴管,進入循環(huán)并最終達到轉(zhuǎn)移部位,在新的部位定居并增殖。細胞的遷移運動能力和侵襲能力是決定腫瘤轉(zhuǎn)移能力的重要因素。腫瘤的遷移涉及細胞骨架和形態(tài)的改變、細胞的粘附和運動,期間參與調(diào)控的有多種生長因子、細胞粘附分子、與細胞運動有關(guān)的小G蛋白(如小G蛋白Rho亞家族的成員RhoA,RhoB和RhoC),骨架調(diào)節(jié)蛋白和趨化因子等。而腫瘤細胞的侵襲能力除了與其增殖和運動遷移能力有關(guān)外,還與其降解細胞外基質(zhì)的能力,如分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)以及一些蛋白酶的激活物,如尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)等有關(guān)。近年來的研究已證明腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移潛力還依賴于腫瘤的微環(huán)境。由于腫瘤轉(zhuǎn)移過程極其復(fù)雜,參與調(diào)控的因素很多,其機制目前仍不很清楚。最新的臨床資料研究,流行病學研究和動物模型為基礎(chǔ)的研究均提示慢性應(yīng)激影響腫瘤的進展,因此由于應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)內(nèi)分泌改變對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響近年來很受關(guān)注。已有一些研究表明交感和腎上腺素系統(tǒng)直接有促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移的作用。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)是體內(nèi)另一個重要應(yīng)激激素,在軀體和心理應(yīng)激時血漿中GC明顯增高。此外,人工合成的GC,如地塞米松(Dex)被臨床廣泛用于治療免疫與炎癥性疾病(如紅斑狼瘡和類風濕性關(guān)節(jié)炎),以及作為重要的輔助藥物用于減輕因腫瘤化療治療帶來的不良反應(yīng)(如過敏,惡心嘔吐等),這些也可導(dǎo)致體內(nèi)GC水平的增高。GC的作用通過糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)介導(dǎo)。作為激素依賴性的轉(zhuǎn)錄因子,激活的GR以二聚體的形式與靶基因啟動子中的糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件(glucocorticoid response element,GRE)結(jié)合,直接地調(diào)節(jié)(促進或者抑制)基因表達,或者通過與其他轉(zhuǎn)錄因子(如NF-κB和AP-1等)相互作用而間接地調(diào)節(jié)基因表達,產(chǎn)生生物學效應(yīng)。近年來的國外和我們的研究都表明GC還可影響細胞內(nèi)多種信號分子的表達和活性,并在細胞內(nèi)的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前認為GC對實體腫瘤的作用主要通過其對免疫系統(tǒng)的作用,即通過其強大的免疫抑制作用,促進腫瘤細胞的免疫逃逸,從而促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。迄今GC對腫瘤細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的研究十分有限,而且已報道的結(jié)果因腫瘤細胞的類型以及所用的腫瘤模型不同而各異,既有促進作用,也有抑制作用,至今不明確,其作用機制也不清楚,因此這方面有進一步研究的必要。卵巢癌是婦科致死率最高的腫瘤。大于70%的卵巢癌在發(fā)現(xiàn)時就已是晚期,伴有盆腹腔或遠處轉(zhuǎn)移。但目前對于卵巢癌轉(zhuǎn)移的機制還不清楚,因此研究卵巢癌的轉(zhuǎn)移十分必要。已有的研究表明卵巢癌組織中g(shù)r的陽性率高達88%,比er和pr都高,表明gc/gr信號通路在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中起著十分重要的作用。國外和我們實驗室的研究發(fā)現(xiàn)gc能輕度抑制卵巢癌細胞的增殖,增強卵巢癌細胞與細胞外基質(zhì)的粘附,改變多種與細胞存活和凋亡相關(guān)的信號通路促進化療藥作用下卵巢癌細胞的存活。有研究表明遠處轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中g(shù)r的靶基因糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(gilz)高表達,且高表達的gilz能激活pi3k/akt的通路,促進卵巢癌的增殖和侵襲,這強烈提示gc與卵巢癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。既往的研究也證實作為應(yīng)激激素之一的gc對卵巢癌細胞侵襲有促進也有抑制作用。是否與卵巢癌細胞的來源和侵襲性的不同而有差異還不很清楚,有進一步研究的必要。因此本課題研究了gc在體外和體內(nèi)對卵巢癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響,并在此基礎(chǔ)上進一步探討了gc促進卵巢癌細胞遷移侵襲的機制。二、研究方法我們在卵巢癌ho-8910、skov3和a2780細胞中進行體外實驗,100nmdex(人工合成的gc)處理細胞,用含10%去激素血清的培養(yǎng)基以去除血清中的激素對細胞的影響。羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色肌動蛋白(actin),共聚焦顯微鏡拍照。transwell小室和細胞劃痕實驗分別檢測細胞的垂直和水平遷移能力。預(yù)包被matrigel膠的transwell小室(侵襲小室)檢測細胞的侵襲能力。細胞粘附實驗檢測細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力。rho-gtppulldown實驗檢測rhob和rhoc的活性。westernblot檢測蛋白的表達和蛋白的磷酸化水平。sirna干擾實驗抑制目的基因的表達。流式細胞儀檢測細胞表面整合素的分布。elisa方法檢測纖連蛋白(fn)的分泌。體內(nèi)實驗我們采用babl/c裸鼠腹腔注射卵巢癌細胞制備轉(zhuǎn)移瘤模型。飲水中給予皮質(zhì)酮(小鼠體內(nèi)的gc)升高裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平。放射免疫方法檢測裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平。he染色確定轉(zhuǎn)移灶的病理性質(zhì)。嘌呤霉素篩選法篩選穩(wěn)定干擾rhob的卵巢癌細胞。三、研究結(jié)果(一)gc在體外和體內(nèi)均能促進卵巢癌細胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。1、人工合成的gc-地塞米松(dex)在體外能促進卵巢癌細胞形態(tài)發(fā)生纖維樣改變,誘導(dǎo)細胞骨架重組(應(yīng)力纖維增多),增強細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力,促進細胞遷移和侵襲。2、在babl/c裸鼠腹腔注射卵巢癌細胞制備的轉(zhuǎn)移瘤模型中,給予皮質(zhì)酮(小鼠體內(nèi)的gc)飲水(50mg/l)能明顯升高裸鼠血漿皮質(zhì)酮水平,并在體內(nèi)促進卵巢癌細胞腹腔和肝臟轉(zhuǎn)移。(二)gc能影響多種轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路分子的表達和/或活性,促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。1、糖皮質(zhì)激素受體(gr)拮抗劑ru486能完全阻斷dex對卵巢癌細胞的遷移促進作用,表明dex對卵巢癌細胞的促遷移作用通過gr介導(dǎo)。2、dex能促進卵巢癌細胞表達和分泌重要的細胞外基質(zhì)成分-纖連蛋白(fn),并能增加細胞粘附分子整合素β1和α5(fn的受體)在卵巢癌細胞表面的分布,用fnsirna干擾fn的表達能明顯抑制dex對卵巢癌細胞的粘附、遷移和侵襲的促進作用。3、dex能激活pi3k/akt信號通路,其激活最早的時間點在12小時,表明激活pi3k/akt信號通路不是dex的直接作用,fnsirna干擾fn的表達能明顯抑制pi3k/akt信號通路的激活,提示整合素α5β1和fn結(jié)合導(dǎo)致的細胞粘附增強可能與pi3k/akt信號通路的激活有關(guān)。用pi3k/akt通路的抑制劑wortmanin能完全阻斷dex誘導(dǎo)卵巢癌細胞骨架重組和dex對卵巢癌細胞的遷移和侵襲的促進作用,表明pi3k/akt通路的激活在dex促進卵巢癌細胞遷移和侵襲的作用中十分重要。4、小g蛋白rho亞家族(rhoa,rhob和rhoc)是重要的細胞遷移和運動的調(diào)控蛋白,與gtp結(jié)合是它們的活性形式。我們發(fā)現(xiàn)dex能激活rhob和rhoc,dex還能增加rho下游的rock2蛋白的磷酸化水平,激活rock2。rock2的特異抑制劑fasudil抑制rock2的活性后能明顯抑制dex對卵巢癌細胞的遷移和侵襲的促進作用。5、鑒于rhoa和rhoc促進細胞遷移的作用已經(jīng)十分明確,而rhob在細胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用還不清楚,因此我們重點研究了dex激活rhob在其促進卵巢癌細胞黏附、遷移、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移中可能的作用。體外實驗發(fā)現(xiàn)用rhobsirna干擾rhob表達能抑制dex促進fn分泌以及激活pi3k/akt信號通路的作用。更為重要的是,干擾rhob的表達在體外能顯著抑制dex對卵巢癌細胞的粘附、遷移和侵襲的促進作用,在體內(nèi)也能明顯抑制皮質(zhì)酮促進卵巢癌細胞肝轉(zhuǎn)移的作用。6、dex還能上調(diào)卵巢癌細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶mmp3和mmp7的表達。用BB-94抑制MMPs的活性能明顯阻斷Dex對卵巢癌細胞的侵襲促進作用。四、結(jié)論GC在體外和體內(nèi)均能促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移,該作用通過GR介導(dǎo)。GC能通過促進FN/integrin介導(dǎo)的粘附激活PI3K/AKT信號通路,并能激活RhoC/ROCK2信號通路,在GC促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。GC還能通過上調(diào)和激活小G蛋白RhoB促進卵巢癌細胞的遷移、侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移,該作用與其促進FN分泌,增加細胞黏附進而激活PI3K/AKT信號通路有關(guān)。此外GC上調(diào)的MMP3和MMP7表達也與GC促進卵巢癌細胞的侵襲密切相關(guān)。以上結(jié)果首次揭示了GC能通過影響細胞內(nèi)多種重要信號分子的表達和活性促進卵巢癌的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

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本文編號：1601199