發(fā)布時(shí)間：2018-03-11 00:02

  本文選題：宮頸癌　切入點(diǎn)：腫瘤抑制基因　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在女性腫瘤中均居第四位；在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中僅次于乳腺癌,居第二位。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)下屬的國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Cancer Research Institute, IRAC)公布的2012年全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,宮頸癌每年的新發(fā)病例約為528,000例,死亡病例約為266,000例。宮頸癌的發(fā)病率在不同國(guó)家之間差距較大,約有70%的新發(fā)病例集中在發(fā)展中國(guó)家；其中,中國(guó)新發(fā)病例的比例約占11.7%,死亡病例約占11.1%。中國(guó)國(guó)家癌癥中心發(fā)布了2015年中國(guó)癌癥預(yù)計(jì)發(fā)病及死亡情況。宮頸癌的新發(fā)病例和死亡病例預(yù)計(jì)約為98,900例和30,500例,且其發(fā)病趨勢(shì)及死亡趨勢(shì)均與發(fā)達(dá)國(guó)家相反,呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。甚至有數(shù)據(jù)顯示,到2030年,宮頸癌的年致死病例將達(dá)到474,000例,約有95%發(fā)生在中低收入國(guó)家,之所以造成如此顯著差異的主要原因是欠發(fā)達(dá)地區(qū)缺乏有效的篩查和早診早治措施。因此,在中國(guó)尋找宮頸癌篩查的有效方法,篩查出宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)以及腫瘤患者,實(shí)施有效的早期干預(yù)措施具有重要意義。目前應(yīng)用最廣泛的宮頸癌篩查方法為宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查和高危型HPV檢測(cè)。然而,這兩種方法均存在自身的局限性,影響了篩查的效果。液基細(xì)胞學(xué)檢查的局限性表現(xiàn)在：(1)敏感性較低,一項(xiàng)覆蓋歐洲和北美6萬(wàn)余人次的數(shù)據(jù)顯示,細(xì)胞學(xué)檢查在初篩過(guò)程中遺漏了約有一半的CIN2、CIN3及宮頸癌(CIN2+)患者,常造成對(duì)患者的漏診漏治；(2)細(xì)胞學(xué)涂片的取材、制片、閱片水平參差不齊,缺乏規(guī)范化的質(zhì)量控制,主觀依賴性強(qiáng)。高危型HPV檢測(cè)的局限性表現(xiàn)在：(1)高危型HPV的終生感染風(fēng)險(xiǎn)為80%,HPV檢測(cè)雖能提高靈敏度,但無(wú)法區(qū)分一過(guò)性HPV感染和致病性持續(xù)感染；(2)育齡期婦女,尤其是年齡小于30歲的女性HPV的感染率高,臨床提示意義較弱。單一依賴HPV篩查,其較低的特異性易造成有限的社會(huì)、醫(yī)療資源的浪費(fèi)及對(duì)患者的過(guò)診過(guò)治。綜上所述,在宮頸癌篩查的臨床實(shí)踐過(guò)程中,尋找不依托于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察、診斷效能高且簡(jiǎn)便易行的分子生物學(xué)篩查標(biāo)記物迫在眉睫。DNA甲基化,即未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤(Cytosine-phosphate-Guanosine, CpG)二核苷酸發(fā)生甲基化。甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾機(jī)制,腫瘤組織中存在著基因組普遍的低甲基化和局部區(qū)域的過(guò)甲基化現(xiàn)象。腫瘤抑制基因發(fā)生雜合性丟失(loss of heterozygosity, LOH)、基因突變、異常甲基化等變化導(dǎo)致正常功能喪失時(shí),細(xì)胞的增殖失控形成惡性腫瘤。DNA甲基化是腫瘤抑制基因功能失活和轉(zhuǎn)錄抑制的關(guān)鍵機(jī)制之一,且在某些情況下可能是唯一的機(jī)制。腫瘤抑制基因啟動(dòng)子的過(guò)甲基化,在包括宮頸癌在內(nèi)的許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段,均有其特異性的改變模式；在進(jìn)展的過(guò)程中,由于啟動(dòng)子的過(guò)甲基化,引起了不同腫瘤抑制基因的失活。表觀遺傳學(xué)改變的累加效應(yīng)在宮頸由正常組織—癌前病變—宮頸癌的發(fā)展過(guò)程中有著重要的意義。因此,作為癌癥發(fā)生的早期事件,DNA甲基化檢測(cè)可以在宮頸癌前病變階段做出分子學(xué)診斷,分流出亟需臨床干預(yù)措施的人群,為宮頸癌的篩查和早診早治提供新的方法。國(guó)內(nèi)外研究者利用腫瘤抑制基因的甲基化檢測(cè),已經(jīng)在很多腫瘤的篩查研究中取得了巨大的進(jìn)展。在宮頸癌篩查的應(yīng)用中,一些腫瘤抑制基因的甲基化檢測(cè)呈現(xiàn)潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。但是仍存在一些問(wèn)題,如：(1)診斷效能欠佳：與高危HPV相比,一些甲基化分子標(biāo)記物的敏感性顯著下降；穩(wěn)定性差、呈現(xiàn)較強(qiáng)的異質(zhì)性,即使同一基因在不同研究之間也存在較大差異；(2)多數(shù)研究在臨床應(yīng)用方面未進(jìn)行深入、詳盡的探討,一些臨床應(yīng)用的熱點(diǎn)未有涉及；臨床樣本量較小,代表性較差。本課題將分兩部分進(jìn)行研究和探討：第一部分 宮頸癌篩查的甲基化分子標(biāo)記物的篩選和驗(yàn)證背景和目的宮頸癌是一種常見(jiàn)的婦科腫瘤,嚴(yán)重危害婦女健康。DNA異常甲基化作為癌癥發(fā)生的早期事件,在從正常宮頸—癌前病變—癌的發(fā)展過(guò)程中呈現(xiàn)出階段特異性及累加性。本研究通過(guò)分析多個(gè)甲基化分子標(biāo)記物的甲基化水平與病變嚴(yán)重程度之間的關(guān)系,以篩選出高級(jí)別病變特異性的甲基化分子標(biāo)記物。材料和方法1.結(jié)合文獻(xiàn)及The Cancer Genome Atlas (TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析,篩選出宮頸癌特異性的過(guò)甲基化腫瘤抑制基因,針對(duì)同一基因的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。2.應(yīng)用甲基化特異性PCR (Methylmion Specific PCR, MSP)在43例宮頸癌組織及27例正常對(duì)照的宮頸組織中初步篩選出差異顯著的甲基化位點(diǎn)。3.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量甲基化PCR (QMSP):(1)在訓(xùn)練集(train set)—267例有明確病理檢查結(jié)果的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本中,對(duì)初步篩選出的差異顯著的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證及進(jìn)一步篩選。(2)將進(jìn)一步篩選出的甲基化位點(diǎn),經(jīng)測(cè)試集(test set)—224例有明確病理檢查結(jié)果的宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本驗(yàn)證,分析其與訓(xùn)練集相關(guān)數(shù)據(jù)的一致性。(3)應(yīng)用焦磷酸測(cè)序的方法對(duì)進(jìn)一步篩選出的特異性甲基化位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證及分析。結(jié)果1.綜合分析篩選出甲基化異�；駽CNA1、CADM1、DAPK1、JAM3,設(shè)計(jì)多個(gè)位點(diǎn)的引物。經(jīng)引物特異性驗(yàn)證后,選定4個(gè)基因的共27個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行MSP檢測(cè)。2.MSP檢測(cè)初步篩選出在宮頸癌組織和正常宮頸組織中甲基化程度差異最顯著的5個(gè)位點(diǎn)。這5個(gè)位點(diǎn)分別為(CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、 DAPK1-M3及JAM3-M4,其在宮頸癌組織中的甲基化陽(yáng)性率分別為65.1%(28/43)、74.4%(32/43)、69.8%(30/43)、76.7%(33/43)及86.0%(37/43)；在正常組織中的甲基化陽(yáng)性率分別為22.2%(6/27)、0.0%(0/27)、11.1%(3/27)、7.4%(2/27)及7.4%(2/27),5個(gè)位點(diǎn)組間差異的P值均0.001。3.臨床實(shí)踐中的篩查界值一般為高級(jí)別病變。當(dāng)界值分別為CIN2和CIN3時(shí),其對(duì)應(yīng)的診斷分類為CIN2+/CIN1-(CIN1和正常對(duì)照)及CIN3+(CIN3和癌)／CIN2-(CIN2, CIN1和正常對(duì)照)。鑒于CIN2的異質(zhì)性,本研究還對(duì)診斷分類CIN3+/CIN1-進(jìn)行了分析。在訓(xùn)練集中,經(jīng)QMSP的驗(yàn)證和進(jìn)一步篩選,提示：(1)分析基因位點(diǎn)的甲基化水平與宮頸病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性：①除DAPK1-M3外,CADM1-M2、CADM1-M8、DAPK1-M2、JAM3-M4等4個(gè)位點(diǎn)在CIN1-和CIN3+兩組間均存在顯著差異；②DAPK1-M2、DAPK1-M3、JAM3-M4等3個(gè)位點(diǎn)在CINl-和CIN2兩組間存在顯著差異③JAM3-M4在CIN1-、CIN2及CIN3+中的任兩組間都存在顯著差異。(2)應(yīng)用logistic回歸分析基因甲基化位點(diǎn)單獨(dú)或聯(lián)合的診斷效能：①對(duì)于CIN3+/CIN1-和CIN3+/CIN2-診斷分類,單獨(dú)應(yīng)用JAM3-M4即可得到最優(yōu)診斷效能；②對(duì)于CIN2+/CIN1-診斷分類,CADM1-M8(P=0.001)、DAPK1-M3 (P=0.038)和JAM3-M4 (P=0.011)聯(lián)合的診斷效能最優(yōu),但是3個(gè)基因聯(lián)合的受試者工作特征曲線下面積(the area under the receiver operating characteristic curve, AUC)為0.806,只略高于單獨(dú)應(yīng)用JAM3-M4的AUC (AUC=0.793)�；诖�,為了統(tǒng)一各個(gè)診斷分類,我們?cè)诤罄m(xù)的分析及驗(yàn)證中選取了JAM3-M4位點(diǎn)。在測(cè)試集中,經(jīng)QMSP驗(yàn)證,提示：對(duì)于訓(xùn)練集中的CIN3+/CIN1-、CN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類,JAM3-M4的AUC分別為0.907、0.860和0.793。對(duì)于測(cè)試集的CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類,JAM3-M4的AUC分別為0.900、0.870和0.765；其診斷效能在訓(xùn)練集和測(cè)試集中呈現(xiàn)較高的一致性。4.經(jīng)焦磷酸測(cè)序驗(yàn)證,JAM3-M4的甲基化率在CIN1-、CIN2及CIN3+中的任兩組間都存在顯著差異。結(jié)論JAM3-M4的甲基化水平隨宮頸病變程度的加重逐漸升高。對(duì)于CIN3+/cIN1-、 CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類,JAM3-M4在各組間均呈現(xiàn)較一致的、較穩(wěn)定的顯著差異,提示其可成為宮頸高級(jí)別病變的分子生物學(xué)標(biāo)記物,在宮頸癌的篩查中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。第二部分甲基化分子標(biāo)記物JAM3-M4在宮頸癌篩查中的應(yīng)用背景和目的宮頸癌作為一個(gè)病因相對(duì)明確的腫瘤,是WHO唯一建議在世界范圍內(nèi)開(kāi)展篩查的惡性腫瘤。從HPV感染到宮頸癌一般需要10到20年,這為臨床上宮頸癌的篩查以及在癌前病變階段實(shí)行有效的干預(yù)措施提供了可能。目前應(yīng)用最廣泛的宮頸癌篩查方法為宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查和高危型HPV檢測(cè)�；诘谝徊糠值难芯�,JAM3-M4在宮頸癌的篩查中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。我們接下來(lái)將JAM3-M4與常用篩查方法進(jìn)行比較,并分析其在單獨(dú)應(yīng)用、聯(lián)合應(yīng)用及分流應(yīng)用等方面的價(jià)值；另外,分析其對(duì)異質(zhì)性CIN2的分流作用。材料和方法1.收集患者的臨床資料,包括患者基本信息、臨床上常用篩查方法(宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查及高危HPV檢測(cè))的結(jié)果；比較常用篩查方法與JAM3-M4的診斷效能。2.在訓(xùn)練集患者中,利用ROC曲線分析JAM3-M4在各種臨床應(yīng)用中的診斷效能(AUC、敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值)；結(jié)合臨床實(shí)踐,研究及探索診斷效能較高、應(yīng)用意義較大的JAM3-M4篩查方案。另外,進(jìn)一步在測(cè)試集的患者中驗(yàn)證其診斷效能的一致性。3.對(duì)CIN2的活檢病理切片進(jìn)行免疫組化P16染色,結(jié)合CIN2的JAM3-M4的甲基化狀態(tài),探討兩者的相關(guān)性及JAM3-M4分流CIN2的可行性。結(jié)果1.與細(xì)胞學(xué)檢查和高危HPV檢測(cè)相比,在CIN3+/CIN1-、CIN3+/Cin2-及CIN2+/CIN1-診斷分類中,JAM3-M4能顯著提高診斷的特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。2.在臨床實(shí)踐中,JAM3-M4的以下應(yīng)用有較好前景：(1)分流作用：①分流高危HPV檢測(cè)陽(yáng)性的患者時(shí),與細(xì)胞學(xué)檢查相比,JAM3-M4在CIN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類中均能顯著提高診斷的特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；陰性預(yù)測(cè)值也有一定升高；②分流細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為ASCUS和LSIL的患者時(shí),與高危HPV檢測(cè)相比,JAM3-M4在CIN3+/CIN1-、 CIN3+/CIN2-及CIN2+/cin1-診斷分類中均能顯著提高診斷的特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；③經(jīng)驗(yàn)證,在訓(xùn)練集及測(cè)試集中,.JAM3-M4分流高危HPV陽(yáng)性及細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS和LSIL的患者時(shí),診斷效能的一致性較好；④對(duì)于19例年齡為30歲以下的ASCUS患者,高危HPV均為陽(yáng)性；其中15例經(jīng)病理診斷為CIN1-,這些患者的JAM3-M4均為陰性。(2)聯(lián)合作用：①與細(xì)胞學(xué)檢查和高危HPV檢測(cè)聯(lián)用相比,JAM3-M4和細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)用在CN3+/CIN1-、CIN3+/CIN2-及CIN2+/CIN1-診斷分類中均能顯著提高診斷的特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；②經(jīng)驗(yàn)證,JAM3-M4在訓(xùn)練集及測(cè)試集中,與細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)用的診斷效能一致性較好。3.CIN2中,免疫組化P16染色的陽(yáng)性率為69.9%,JAM3-M4的陽(yáng)性率為48.8%,兩者的相符率為60.5%。結(jié)論與常用的篩查方法相比,JAM3-M4能顯著提高診斷效能,在宮頸癌早期篩查中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。1.JAM3-M4可用于分流高危HPV檢測(cè)陽(yáng)性及細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為ASCUS尤其是年齡小于30歲的患者)、LSIL的患者。2. JAM3-M4與細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合應(yīng)用可提高診斷效能。3.對(duì)于臨床上爭(zhēng)議較大的異質(zhì)性強(qiáng)的CIN2, JAM3-M4有一定的分流效能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33
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本文編號(hào)：1595659