PARP-1和EMT在卵巢癌中的生物學(xué)功能及意義
發(fā)布時(shí)間:2018-03-05 11:33
本文選題:卵巢癌 切入點(diǎn):PARP-1 出處:《山東大學(xué)》2017年博士論文 論文類型:學(xué)位論文
【摘要】:研究背景婦科惡性腫瘤中,卵巢癌的發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌,是女性生殖系統(tǒng)第三大惡性腫瘤,但其死亡率卻居第一位。當(dāng)卵巢癌患者以腹水或盆腔包塊就診時(shí),大多數(shù)已經(jīng)是臨床晚期。卵巢癌減滅術(shù)合并鉑類、紫杉醇為主的聯(lián)合化療是當(dāng)今治療卵巢腫瘤的主要臨床手段。目前,卵巢癌的復(fù)發(fā)及化療耐藥成為困擾臨床的主要障礙。卵巢癌患者對(duì)鉑類為主的聯(lián)合化療初次敏感性達(dá)85%,但大多數(shù)患者最終因化療耐藥而導(dǎo)致復(fù)發(fā)。卵巢癌化療耐藥尤其是鉑類耐藥的發(fā)生機(jī)制及逆轉(zhuǎn)途徑已經(jīng)成為目前重要的研究課題。因此,降低患者復(fù)發(fā)率,逆轉(zhuǎn)化療耐藥,卵巢癌化療耐藥相關(guān)機(jī)制的研究成為目前的首要任務(wù)。近年,腫瘤化療耐藥的研究已經(jīng)取得重要進(jìn)展,耐藥機(jī)制主要包括DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng),耐藥蛋白的過度表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)一些蛋白酶的改變引起細(xì)胞解毒功能增強(qiáng)等。目前腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制主要?dú)w因于DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)。聚酰苷二磷酸核糖聚合酶-1(poly-ADPribose polymerase-1,PARP-1)是存在于絕大多數(shù)真核細(xì)胞的細(xì)胞核中的蛋白質(zhì)翻譯后修飾酶,是PARP家族中在體內(nèi)含量最多也最具特異性的成員。PARP-1位于染色體lq41~42區(qū),包含有23個(gè)外顯子。PARP-1蛋白的分子量為116KDa,包含1014個(gè)氨基酸。通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白質(zhì)和酶進(jìn)行翻譯后修飾,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一系列分子事件。在DNA復(fù)制、DNA的損傷修復(fù)、控制細(xì)胞的增殖分化凋亡、維持基因組的穩(wěn)定等方面,PARP-1發(fā)揮著重要作用。靜息狀態(tài)下,PARP-1在細(xì)胞內(nèi)以非活性狀態(tài)存在。PARP-1對(duì)DNA的損傷異常敏感,當(dāng)出現(xiàn)輻射、化療藥物等致使DNA損傷后,損傷的DNA游離斷端將會(huì)激活PARP-1,活化的PARP-1檢測(cè)到游離的DMA末端并與之結(jié)合,迅速募集與DNA損傷修復(fù)相關(guān)的蛋白到目標(biāo)位點(diǎn),進(jìn)一步激活并催化蛋白受體聚ADP核糖基化,ADP核糖基化與組蛋白H1、H2B結(jié)合后,核小體的正常結(jié)構(gòu)受到影響,進(jìn)一步引起染色體結(jié)構(gòu)松弛,損傷部位易于結(jié)合DNA修復(fù)酶,從而參與斷鏈DNA的損傷修復(fù)。然而當(dāng)存在DNA廣泛損傷時(shí),PARP-1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究顯示,沉默PARP-1基因或應(yīng)用PARP抑制劑能有效提高卵巢癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的化療敏感性。在上皮來源的惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程中,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)發(fā)揮了重要作用。EMT是具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為間質(zhì)細(xì)胞并使其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的過程,在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。EMT不僅在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用,并且與腫瘤化療耐藥也可能存在一定的相關(guān)性。腫瘤細(xì)胞的EMT主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的極性喪失及間質(zhì)細(xì)胞具備遷移浸潤(rùn)能力。它降低了細(xì)胞之間的黏附力、增加了細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)能力,不僅參與胚胎發(fā)育、組織重建、慢性炎癥等過程,也是腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病的重要機(jī)制之一。正常組織的上皮細(xì)胞整齊排列,為具有極性的單細(xì)胞層,細(xì)胞之間黏附緊密而規(guī)律,整齊地附著于基底部的細(xì)胞外基質(zhì)上。間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,沒有極性且細(xì)胞間黏附松散,由于細(xì)胞間黏附性小且無附著部位,因此具有遷移浸潤(rùn)能力。腫瘤細(xì)胞可通過EMT獲得間質(zhì)細(xì)胞表型,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)周圍組織的侵襲浸潤(rùn)。腫瘤細(xì)胞EMT過程中伴有:1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間黏附力,變成不規(guī)則、松散排列的間質(zhì)細(xì)胞;2.細(xì)胞表面標(biāo)記分子表達(dá)改變:如上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-cadherin、層連蛋白等表達(dá)下調(diào);間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白如vimentin、纖維蛋白和SMA等表達(dá)上調(diào);同時(shí)活化Snail、Twist、Slug等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。這些改變導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間黏附力,從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架重組。3.細(xì)胞生物學(xué)行為改變:上皮細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)變?yōu)檫w移浸潤(rùn)能力較強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞,并獲得侵襲、抗凋亡能力的間質(zhì)表型。有研究發(fā)現(xiàn)EMT減低了非小細(xì)胞肺癌組織對(duì)順鉑和紫杉醇的敏感性,由此推斷參與EMT的相關(guān)因子及信號(hào)通路的激活或失調(diào)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐藥的過程中起協(xié)同作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MARK)通路是 EMT過程中的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化及惡性轉(zhuǎn)化等許多生物學(xué)效應(yīng)。MARKs家族包括許多成員,其中在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用的有3種:JNK、p38、ERK。既往研究顯示,PARP-1抑制劑PJ34可抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,提高C13*細(xì)胞對(duì)順鉑化療藥物的敏感性。磷酸化的ERK2激活PARP-1的途徑不同于DNA受損引起的PARP-1活化,由此推斷ERK2可調(diào)控PARP-1表達(dá)。由于激活PARP-1與ERK1/2具有相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,有研究證實(shí)在沒有DNA損傷的情況下,PARP-1可被磷酸化的ERK1/2激活。PARP-1在沒有DNA損傷的情況下被pERK2激活是由于ERK2的磷酸化,而不依賴激酶的活性。pERK2直接作用于某些ERK2的底物使其活化而不依賴激酶的活性。由此我們推斷,MAPK通路因子與PARP-1共同參與EMT,從而影響腫瘤細(xì)胞的化療耐藥。間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白波形蛋白(vimentin)和上皮細(xì)胞標(biāo)記蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)被認(rèn)為是EMT過程中關(guān)鍵的標(biāo)志性分子。Vimentin作為真核生物細(xì)胞中主要的中間纖維,與微管、微絲共同構(gòu)成細(xì)胞支架而維持細(xì)胞的完整性。除了維持細(xì)胞的完整性以外,vimentin的主要功能還包括:①參與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移;②參與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的傳導(dǎo);③參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié);④參與基因組DNA表達(dá)的調(diào)控。其表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),表達(dá)越高,愈后越差。作為EMT、EndoMT的標(biāo)志性分子,vimentin在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)都較正常組織高很多。Vimentin在EMT過程中作為重要的上游調(diào)節(jié)因子發(fā)揮關(guān)鍵作用。其表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),表達(dá)越高,愈后越差。作為上皮細(xì)胞連接的黏附劑,E-cadherin表達(dá)減少或沉默表達(dá)可致上皮細(xì)胞離散、失去極性,這提示E-cadherin與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān),其可作為腫瘤的抑制因子,E-cadherin的表達(dá)減少或沉默表達(dá)與EMT的進(jìn)展存在密切關(guān)系。E-cadherin的表達(dá)下調(diào)與Vimentin的表達(dá)升高相關(guān),Vimentin的表達(dá)會(huì)干擾E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞黏附。在早期卵巢癌中,E-cadherin的表達(dá)增加而不是減少。但是,一旦卵巢癌發(fā)生轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移腹水細(xì)胞顯示,其E-cadherin的表達(dá)比原發(fā)腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)顯著減少。卵巢癌化療耐藥的過程中,PARP-1是否通過與EMT共同作用,影響其化療耐藥,以及對(duì)卵巢癌化療耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲的作用,本文做了進(jìn)一步研究。第一部分PARP-1抑制劑PJ34、ERK抑制劑U0126對(duì)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3生長(zhǎng)、侵襲的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV-3中分別加入PARP-1抑制劑PJ34和ERK1/2抑制劑U0126,檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力,及E-cadherin和vimentin的表達(dá),以探討在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中PJ34、U0126與EMT的相互作用機(jī)制及對(duì)卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3生長(zhǎng)、侵襲的作用。實(shí)驗(yàn)方法:PJ34、U0126干擾卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blotting法檢測(cè)處理后細(xì)胞中E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。MTT法檢測(cè)PJ34、U0126在SKOV-3細(xì)胞增殖中的作用、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PJ34、U0126在SKOV-3細(xì)胞遷移中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:PJ34、U0126明顯抑制卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3的生長(zhǎng)增殖,且PJ34聯(lián)合U0126的作用效果較單用PJ34明顯。PJ34、U0126可提高SKOV-3細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá),vimentin則反之,從而進(jìn)一步抑制卵巢癌耐藥細(xì)胞EMT的進(jìn)展。U0126可增強(qiáng)PJ34對(duì)SKOV-3細(xì)胞生長(zhǎng)侵襲的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.PARP-1和ERK1/2聯(lián)合通過EMT途徑影響卵巢癌耐藥細(xì)胞的生物學(xué)行為。2.PARP-1抑制劑和ERK1/2抑制劑可作為卵巢癌術(shù)后愈后的臨床數(shù)據(jù)分析。3.PARP-1抑制劑和ERK1/2抑制劑的低毒性、高特異性的劑量還需進(jìn)一步研究。4.PARP-1抑制劑聯(lián)合ERK1/2抑制劑可作為卵巢癌靶向治療的新靶點(diǎn)。第二部分PARP-1、E-cadherin和vimentin在卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV-3中的表達(dá)及意義實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過檢測(cè)PARP-1、E-cadherin和vimentin在卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV-3,卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3中的mRNA的水平和蛋白表達(dá)情況,探索卵巢癌順鉑耐藥與PARP-1及EMT的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)方法:實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blotting法檢測(cè)卵巢癌上皮細(xì)胞,卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中PARP-1、E-cadherin、vimentin的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:PARP-1、vimentin在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞SKOV-3陽(yáng)性表達(dá)率高于卵巢癌上皮細(xì)胞SKOV-3,而E-cadherin則相反,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P0.05)。E-cadherin表達(dá)與PARP-1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(P0.05),vimentin表達(dá)與PARP-1表達(dá)呈正相關(guān)(P0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.PARP-1,EMT可影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)鉑類藥物的化療耐藥。2.PARP-1可通過影響EMT中的E-cadherin和vimentin的表達(dá)進(jìn)而影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑藥物的化療耐藥。3.是否還有其他因子與PARP-1共同影響E-cadherin和vimentin的表達(dá),有待于進(jìn)一步研究。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】:山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2017
【分類號(hào)】:R737.31
【參考文獻(xiàn)】
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1 焦今文;趙新衛(wèi);鄧博雅;龐曉燕;溫放;;p38~(MAPK)對(duì)卵巢癌順鉑耐藥作用及機(jī)制的探討[J];中華腫瘤防治雜志;2012年16期
2 柳華;彭芝蘭;;Wnt通路抑制因子甲基化與卵巢癌耐藥的相關(guān)性[J];中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志;2010年04期
,本文編號(hào):1570102
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