本文關(guān)鍵詞： BRIT1 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡 慢病毒　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：BRIT1(BRCT-repeat inhibitor of hTERT expression)，起初是作為人類(lèi)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT： human telomerase reversetranscriptase component）抑制子而被證實(shí)，又稱(chēng)MCPH1(microcephalin)。現(xiàn)研究證實(shí)BRIT1參與DNA損傷應(yīng)答，維持染色體的完整性。此外，有研究表明BRIT1在多個(gè)腫瘤組織表達(dá)缺失，如卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌等。這些結(jié)果表明BRIT1可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。當(dāng)前，，BRIT1在宮頸癌組織中的表達(dá)及其作用尚未得到證實(shí)，故本論文主要研究宮頸癌組織標(biāo)本中BRIT1的表達(dá)和BRIT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡等生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。 第一部分：BRIT1在宮頸標(biāo)本中的表達(dá)分析 目的：檢測(cè)宮頸癌組織和配對(duì)的宮頸非癌組織中的BRIT1表達(dá)情況，比較兩者之間的表達(dá)差異。 方法：應(yīng)用real-time PCR，免疫組織化學(xué)技術(shù)及western blot等方法檢測(cè)宮頸癌組織及其配對(duì)的宮頸非癌組織中BRIT1mRNA和蛋白水平的表達(dá)；并統(tǒng)計(jì)分析免疫組織化學(xué)檢測(cè)的BRIT1的表達(dá)量與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤類(lèi)型、腫瘤的病理分級(jí)和臨床分期之間的關(guān)系。 結(jié)果：Real-time PCR結(jié)果揭示：31例標(biāo)本中的19例（61.3%）宮頸癌組織中BRIT1mRNA的表達(dá)水平低于配對(duì)的宮頸非癌組織中的表達(dá)；免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)果揭示：63例標(biāo)本中的44例（69.8%）宮頸癌組織BRIT1蛋白的表達(dá)低于配對(duì)的宮頸非癌組織中的表達(dá)；統(tǒng)計(jì)分析表明在高級(jí)的病理分級(jí)（1vs.3，P=0.013；2vs.3，P=0.047）和臨床分期（0vs. Ⅲ，P=0.043）中，BRIT1蛋白的表達(dá)減少更為明顯，與患者年齡、腫瘤大小與類(lèi)型無(wú)相關(guān)性；western blot檢測(cè)表明6例宮頸癌組織中BRIT1蛋白的表達(dá)均低于配對(duì)的宮頸非癌組織中的表達(dá)。 結(jié)論：與宮頸非癌組織比較，BRIT1在宮頸癌組織中的表達(dá)減少。BRIT1基因在宮頸癌癌組織和非癌組織中的表達(dá)差異提示BRIT1可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用。 第二部分：人BRIT1基因重組慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及慢病毒的制備 目的：構(gòu)建人BRIT1基因重組慢病毒質(zhì)粒，并包裝成慢病毒顆粒。 方法：將BRIT1基因和慢病毒pLenO-DCE質(zhì)粒經(jīng)酶切反應(yīng)，T4DNA連接酶連接反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLenO-DCE-HA-BRIT1；然后重組質(zhì)粒經(jīng)常規(guī)PCR、瓊脂糖凝膠電泳、限制性?xún)?nèi)切酶酶切和DNA測(cè)序等鑒定后，用Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng)（pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G）共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，包裝成重組慢病毒顆粒，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定重組慢病毒滴度。 結(jié)果：經(jīng)常規(guī)PCR、瓊脂糖凝膠電泳、限制性酶酶切和DNA測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建了BRIT1重組慢病毒質(zhì)粒pLenO-DCE-HA-BRIT1；經(jīng)293T細(xì)胞包裝后，成功獲得病毒滴度為1.24109TU/ml的重組慢病毒Lent-BRIT1。 結(jié)論：為進(jìn)一步建立BRIT1過(guò)表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞株，研究BRIT1對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 第三部分：BRIT1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移的影響 目的：研究BRIT1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞（HeLa、SiHa和CaSki）增殖、周期、凋亡、侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。 方法：慢病毒感染宮頸癌細(xì)胞（HeLa、SiHa和CaSki）后，用熒光顯微鏡觀察重組慢病毒Lent-BRIT1的感染效率；用real-time PCR和western blot等技術(shù)檢測(cè)BRIT1mRNA和蛋白水平的表達(dá)；用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)BRIT1蛋白的表達(dá)及亞細(xì)胞定位；用MTS測(cè)定細(xì)胞增殖能力；用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布和凋亡情況；用劃痕實(shí)驗(yàn)和trans-well實(shí)驗(yàn)測(cè)定慢病毒感染SiHa細(xì)胞后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲能力。 結(jié)果：慢病毒Lent-BRIT1感染HeLa、SiHa、CaSki細(xì)胞72h后，熒光顯微鏡觀察顯示Lent-BRIT1對(duì)三株細(xì)胞的感染效率均大于95%；與陰性對(duì)照組（Lent-control）和未處理組（W/O）比較，HeLa、SiHa和CaSki細(xì)胞的重組慢病毒組（Lent-BRIT1）中BRIT1mRNA和蛋白的表達(dá)明顯增加，且BRIT1蛋白主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，與W/O組中的分布一致；慢病毒Lent-BRIT1介導(dǎo)的BRIT1過(guò)表達(dá)能顯著地抑制HeLa、SiHa、CaSki細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期在S期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；此外，Lent-BRIT1介導(dǎo)的BRIT1過(guò)表達(dá)能顯著地抑制SiHa細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲能力。 結(jié)論：重組慢病毒Lent-BRIT1能高效地感染HeLa、SiHa、CaSki細(xì)胞，并能顯著地介導(dǎo)BRIT1基因過(guò)表達(dá)；BRIT1過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期在S期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制宮頸癌細(xì)胞（HeLa、SiHa和CaSki） 的增殖。第四部分：BRIT1過(guò)表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期和凋亡影響的機(jī)制研究 目的：初步探明BRIT1過(guò)表達(dá)阻滯細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。 方法：提取慢病毒感染SiHa細(xì)胞72h后的蛋白，用western blot方法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和細(xì)胞凋亡相關(guān)因子。 結(jié)果：BRIT1過(guò)表達(dá)上調(diào)p53、p21的表達(dá)，下調(diào)CyclinA2、CyclinB1、CDC2、CDC25C等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)；此外，Lent-BRIT1組細(xì)胞中，凋亡誘導(dǎo)因子Bax的表達(dá)上調(diào)，凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)下調(diào)，線(xiàn)粒體中細(xì)胞色素C（Cyt C）表達(dá)減少，細(xì)胞胞漿中Cyt C檢測(cè)增加，caspase-3和PARP-1剪切激活。 結(jié)論： BRIT1可能調(diào)控p53/p21、 cyclinA2/CDK2、CDC25C-cyclinB/CDC2信號(hào)通路，從而阻滯宮頸癌細(xì)胞S/G2期轉(zhuǎn)化和G2/M期轉(zhuǎn)化，即阻滯細(xì)胞周期在S期。此外，BRIT1通過(guò)啟動(dòng)線(xiàn)粒體凋亡途徑，激活Caspase3，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:BACKGROUND : BRIT1 ( BRIT1 ( BRCT - repeat inhibitor of hTERT expression ) has been proved to be a human telomerase reverse transcriptase ( hTERT ) . It is shown that BRIT1 plays an important role in the development of human telomerase reverse transcriptase ( hTERT ) . The First Part : Expression Analysis of BRIT1 in Cervical Specimens Objective : To compare the expression of BRIT1 in cervical carcinoma with cervical carcinoma and to compare the expression of BRIT1 . Methods : The expression of BRIT1mRNA and protein was detected by real - time PCR , immunohistochemistry and western blot . The relationship between the expression of BRIT1 and the age , tumor size , tumor type , pathological grade and clinical stage was analyzed . Results : The results of real - time PCR showed that the expression level of BRIT1 mRNA was lower in 19 cases ( 61.3 % ) in 31 cases than that in the paired cervical non - cancerous tissues . The results of immunohistochemistry showed that the expression of BRIT1 protein was lower in 44 cases ( 69.8 % ) in 63 specimens than in the paired cervical non - cancerous tissues . Statistical analysis showed that the expression of BRIT1 protein was not correlated with the age of the patient , the size and type of tumor . Western blot analysis showed that the expression of BRIT1 protein in 6 cervical cancer tissues was lower than that in the paired cervical non - cancerous tissue . Conclusion : The expression of BRIT1 gene in cervical cancer tissues and non - cancerous tissues suggests that BRIT1 may play a role in the development of cervical cancer . Second part : construction of human BRIT1 gene recombinant lentivirus plasmid and preparation of lentivirus Objective : To construct the recombinant lentivirus plasmid of human BRIT1 gene and to package it into slow virus particles . Methods : The recombinant plasmid pLeno - DCE - HA - BRIT1 was constructed by restriction enzyme digestion and T4 DNA ligase reaction of BRIT1 gene and slow virus pLeno - DCE plasmid , then the recombinant plasmid was co - transfected with recombinant plasmid and lentivirus packaging plasmid system ( pRsv - REV , pMDlg - pRRE , pMD2G ) by conventional PCR , agarose gel electrophoresis , restriction endonuclease digestion and DNA sequencing . Results : The recombinant lentivirus Lent - BRIT1 was successfully constructed by conventional PCR , agarose gel electrophoresis , restriction enzyme digestion and DNA sequencing . Conclusion : To further establish the BRIT1 overexpression cervical cancer cell line , the influence of BRIT1 on the biological behavior of cervical cancer cells and its mechanism are established . Part 3 : Effects of overexpression of BRIT1 on proliferation , cycle , apoptosis , invasion and metastasis of cervical cancer cells Objective : To study the effects of BRIT1 overexpression on the proliferation , cycle , apoptosis , invasion and metastasis of cervical cancer cells ( HeLa , SiHa and Cavaliantly ) .

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本文編號(hào)：1525116