發(fā)布時間：2018-02-09 11:01

  本文關鍵詞： 卵巢癌 SKOV3細胞株 Beclin1 HLA 自噬 免疫逃避　出處：《河北醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：本實驗通過使用帶有DDK標簽的Beclin1表達載體轉(zhuǎn)染細胞,觀察HLA在人類卵巢癌細胞SKOV3中的表達情況，探討自噬基因Beclin1對HLA基因蛋白表達的影響和與卵巢癌臨床病理學的關系,并初步探討B(tài)eclin1在過表達的情況下對人卵巢癌細胞SKOV3免疫學方面的影響，從自噬對免疫影響這一方面進一步闡明Beclin1表達在卵巢癌發(fā)生及進展中所起的作用，本研究結果可為卵巢癌的病因研究及臨床免疫治療提供一定的理論基礎和可行的思路。 方法： 1利用細胞基因轉(zhuǎn)染技術、Real Time-PCR、RT-PCR及Western blot實驗方法研究外源性Beclin1過表達后對卵巢癌細胞SKOV3的HLA抗原表達情況的影響。 2通過MTT法分析外源性Beclin1過表達后對卵巢癌細胞SKOV3增殖活性的影響情況。 3在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后卵巢癌細胞的自噬現(xiàn)象。 結果： 1將pCMV6-Entry-Beclin1和pCMV6-Entry表達載體轉(zhuǎn)染到SKOV3細胞中，通過RT-PCR結果顯示：與空白對照組相比較，轉(zhuǎn)染pCMV6-Entry-Beclin1載體后，Beclin1基因表達明顯提高，提示表達載體可用于后續(xù)的實驗。 2為了探討B(tài)eclin1和HLA在卵巢癌中的生物學行為，本實驗采用瞬時轉(zhuǎn)染技術，將pCMV6-Entry-Beclin1和pCMV6-Entry轉(zhuǎn)染SKOV3細胞中，再從mRNA和蛋白表達及細胞增殖等方面觀察HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ的表達情況的變化。 2.1pCMV6-Entry-Beclin1轉(zhuǎn)染SKOV3細胞(SKOV3-Beclin1group)后，Beclin1和HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ在mRNA及蛋白表達水平上均高于空載體組(SKOV3-Entry group)及未轉(zhuǎn)染組(SKOV3group)。 2.2MTT結果顯示，與空載體組和空白對照組相比，SKOV3-Beclin1組細胞生長明顯受到抑制。在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h后，SKOV3-Beclin1組細胞的生長抑制率分別為42.60%，37.87%，24.35%,4.81%.綜上結果表明，pCMV6-Entry-Beclin1轉(zhuǎn)染后可明顯抑制SKOV3細胞的增殖活性。 2.3RT-PCR檢測各組細胞中Beclin1基因及HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ等位基因表達結果顯示，空白組、轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)染組各組細胞中Beclin1基因的表達量分別為0.6609±0.0457，1.5973±0.1491，0.6661±0.0316。HLA-Ⅰ等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C在以上各組細胞表達情況分別為0.8223±0.0704，1.6227±0.2427，0.7835±0.0842；0.6785±0.15271，0.4491±0.2191，0.5992±0.1705；0.6626±0.0803，1.2284±0.1742，0.6820±0.0591。HLA-Ⅱ等位基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR在以上各組細胞的表達情況分別為0.5043±0.1030，1.6283±0.1698，0.4844±0.1731；0.2551±0.1128，1.1219±0.2517,0.3212±0.1598；0.5670±0.0642，1.5132±0.2356，0.5014±0.2524。各組細胞的試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較和非參數(shù)檢驗均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 2.4Real Time RT-PCR檢測各組細胞中Beclin1基因及HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ等位基因表達結果顯示，空白組，轉(zhuǎn)染組，空轉(zhuǎn)染組各組細胞中Beclin1基因表達分別為1.3861±0.0066，9.2922±0.2715，1.8350±0.1015；HLA-Ⅰ等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C在以上各組細胞表達情況分別為5.9848±0.0783，14.5475±0.0545，6.0894±0.0140；1.7167±0.0580，2.7984±0.1515，1.7973±0.0192；3.8161±0.0449，12.1393±0.0463，4.6966±0.1527。HLA-Ⅱ等位基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR在以上各組細胞中表達的情況分別為6.8787±0.1833，16.7675±0.4850，7.6501±0.4856；2.9097±0.2281，25.5259±0.7104，3.8230±0.1273；6.1550±0.0511，19.1355±0.6053，6.3781±0.1222。各組細胞的試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較和非參數(shù)檢驗均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 2.5Western blot法檢測空白組、轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組各組細胞中Beclin1及HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ蛋白抗體表達結果顯示，在以上各組細胞中Beclin1蛋白的表達量分別為5.6656±0.8535，11.6792±2.8931，5.1258±0.6148。HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ蛋白在以上各組細胞表達的情況分別為0.2131±0.0421，，0.4208±0.0989，0.2208±0.0564；0.2143±0.0544，0.3503±0.0778,0.2143±0.0543。各組細胞試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 2.6熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染Beclin1組中MDC標記的自噬熒光信號強度最高，胞漿內(nèi)出現(xiàn)了明顯的綠色熒光信號。 結論： 1自噬基因Beclin1過表達可以抑制SKOV3細胞的增殖，自噬基因Beclin1對卵巢癌的基因治療可能具有一定的可行性。 2HLA的表達下調(diào)可能增加了卵巢癌細胞的免疫逃避，而自噬可能會促進機體對腫瘤細胞的免疫反應，通過自噬提高機體免疫可成為免疫療法的一種新的思路。
[Abstract]:Objective: through the use of DDK tagged Beclin1 expression vector transfected cells and investigate the expression of HLA in human ovarian cancer cell line SKOV3, to investigate the influence of Beclin1 gene on the expression of HLA protein and the relationship with the clinical pathology of ovarian cancer, and explore the effect of Beclin1 on human ovarian cancer cell SKOV3 immunology the over expression situation, from this aspect of autophagy on the immune effect and further clarify the expression of Beclin1 plays in the onset and progression of ovarian cancer, the results of this study can provide a theoretical basis and feasible way to study the etiology of ovarian cancer and clinical immunotherapy.
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本文編號：1497779