本文關(guān)鍵詞： 卵巢癌 SKOV3細(xì)胞株 Beclin1 HLA 自噬 免疫逃避　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：本實(shí)驗(yàn)通過使用帶有DDK標(biāo)簽的Beclin1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞,觀察HLA在人類卵巢癌細(xì)胞SKOV3中的表達(dá)情況，探討自噬基因Beclin1對HLA基因蛋白表達(dá)的影響和與卵巢癌臨床病理學(xué)的關(guān)系,并初步探討B(tài)eclin1在過表達(dá)的情況下對人卵巢癌細(xì)胞SKOV3免疫學(xué)方面的影響，從自噬對免疫影響這一方面進(jìn)一步闡明Beclin1表達(dá)在卵巢癌發(fā)生及進(jìn)展中所起的作用，本研究結(jié)果可為卵巢癌的病因研究及臨床免疫治療提供一定的理論基礎(chǔ)和可行的思路。 方法： 1利用細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染技術(shù)、Real Time-PCR、RT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)方法研究外源性Beclin1過表達(dá)后對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的HLA抗原表達(dá)情況的影響。 2通過MTT法分析外源性Beclin1過表達(dá)后對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖活性的影響情況。 3在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后卵巢癌細(xì)胞的自噬現(xiàn)象。 結(jié)果： 1將pCMV6-Entry-Beclin1和pCMV6-Entry表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到SKOV3細(xì)胞中，通過RT-PCR結(jié)果顯示：與空白對照組相比較，轉(zhuǎn)染pCMV6-Entry-Beclin1載體后，Beclin1基因表達(dá)明顯提高，提示表達(dá)載體可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 2為了探討B(tài)eclin1和HLA在卵巢癌中的生物學(xué)行為，本實(shí)驗(yàn)采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將pCMV6-Entry-Beclin1和pCMV6-Entry轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞中，再從mRNA和蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖等方面觀察HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ的表達(dá)情況的變化。 2.1pCMV6-Entry-Beclin1轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞(SKOV3-Beclin1group)后，Beclin1和HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ在mRNA及蛋白表達(dá)水平上均高于空載體組(SKOV3-Entry group)及未轉(zhuǎn)染組(SKOV3group)。 2.2MTT結(jié)果顯示，與空載體組和空白對照組相比，SKOV3-Beclin1組細(xì)胞生長明顯受到抑制。在轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h和96h后，SKOV3-Beclin1組細(xì)胞的生長抑制率分別為42.60%，37.87%，24.35%,4.81%.綜上結(jié)果表明，pCMV6-Entry-Beclin1轉(zhuǎn)染后可明顯抑制SKOV3細(xì)胞的增殖活性。 2.3RT-PCR檢測各組細(xì)胞中Beclin1基因及HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ等位基因表達(dá)結(jié)果顯示，空白組、轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)染組各組細(xì)胞中Beclin1基因的表達(dá)量分別為0.6609±0.0457，1.5973±0.1491，0.6661±0.0316。HLA-Ⅰ等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C在以上各組細(xì)胞表達(dá)情況分別為0.8223±0.0704，1.6227±0.2427，0.7835±0.0842；0.6785±0.15271，0.4491±0.2191，0.5992±0.1705；0.6626±0.0803，1.2284±0.1742，0.6820±0.0591。HLA-Ⅱ等位基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR在以上各組細(xì)胞的表達(dá)情況分別為0.5043±0.1030，1.6283±0.1698，0.4844±0.1731；0.2551±0.1128，1.1219±0.2517,0.3212±0.1598；0.5670±0.0642，1.5132±0.2356，0.5014±0.2524。各組細(xì)胞的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較和非參數(shù)檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 2.4Real Time RT-PCR檢測各組細(xì)胞中Beclin1基因及HLA-Ⅰ及HLA-Ⅱ等位基因表達(dá)結(jié)果顯示，空白組，轉(zhuǎn)染組，空轉(zhuǎn)染組各組細(xì)胞中Beclin1基因表達(dá)分別為1.3861±0.0066，9.2922±0.2715，1.8350±0.1015；HLA-Ⅰ等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C在以上各組細(xì)胞表達(dá)情況分別為5.9848±0.0783，14.5475±0.0545，6.0894±0.0140；1.7167±0.0580，2.7984±0.1515，1.7973±0.0192；3.8161±0.0449，12.1393±0.0463，4.6966±0.1527。HLA-Ⅱ等位基因HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR在以上各組細(xì)胞中表達(dá)的情況分別為6.8787±0.1833，16.7675±0.4850，7.6501±0.4856；2.9097±0.2281，25.5259±0.7104，3.8230±0.1273；6.1550±0.0511，19.1355±0.6053，6.3781±0.1222。各組細(xì)胞的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較和非參數(shù)檢驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 2.5Western blot法檢測空白組、轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組各組細(xì)胞中Beclin1及HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ蛋白抗體表達(dá)結(jié)果顯示，在以上各組細(xì)胞中Beclin1蛋白的表達(dá)量分別為5.6656±0.8535，11.6792±2.8931，5.1258±0.6148。HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ蛋白在以上各組細(xì)胞表達(dá)的情況分別為0.2131±0.0421，，0.4208±0.0989，0.2208±0.0564；0.2143±0.0544，0.3503±0.0778,0.2143±0.0543。各組細(xì)胞試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析SNK兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 2.6熒光顯微鏡觀察到轉(zhuǎn)染Beclin1組中MDC標(biāo)記的自噬熒光信號強(qiáng)度最高，胞漿內(nèi)出現(xiàn)了明顯的綠色熒光信號。 結(jié)論： 1自噬基因Beclin1過表達(dá)可以抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，自噬基因Beclin1對卵巢癌的基因治療可能具有一定的可行性。 2HLA的表達(dá)下調(diào)可能增加了卵巢癌細(xì)胞的免疫逃避，而自噬可能會促進(jìn)機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)，通過自噬提高機(jī)體免疫可成為免疫療法的一種新的思路。
[Abstract]:Objective: through the use of DDK tagged Beclin1 expression vector transfected cells and investigate the expression of HLA in human ovarian cancer cell line SKOV3, to investigate the influence of Beclin1 gene on the expression of HLA protein and the relationship with the clinical pathology of ovarian cancer, and explore the effect of Beclin1 on human ovarian cancer cell SKOV3 immunology the over expression situation, from this aspect of autophagy on the immune effect and further clarify the expression of Beclin1 plays in the onset and progression of ovarian cancer, the results of this study can provide a theoretical basis and feasible way to study the etiology of ovarian cancer and clinical immunotherapy.
Method錛

本文編號：1497779