發(fā)布時(shí)間：2018-01-24 04:27

  本文關(guān)鍵詞： 卵巢癌 Nedd4L 增殖 抑制 生物行為　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:研究Nedd4L在卵巢上皮癌的表達(dá)及對卵巢癌細(xì)胞生長、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響及相關(guān)的作用機(jī)制,探尋治療卵巢癌的靶基因。方法:1.應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測Nedd4L在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織以及卵巢癌組織這種中的表達(dá);2.采用卡方檢驗(yàn)分析Nedd4L表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理學(xué)特點(diǎn)的關(guān)系;3.采用Ka Plan-Meier分析Nedd4L表達(dá)與患者疾病特異性生存時(shí)間的關(guān)系;4.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將含有Nedd4L的真核表達(dá)載體pc DNA3.1(+)-Nedd4L導(dǎo)入人卵巢癌細(xì)胞系SKVO3中,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR方法、免疫組織化學(xué)染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色驗(yàn)證Nedd4L在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)情況;5.含有Nedd4L的真核表達(dá)載體pc DNA3.1(+)-Nedd4L導(dǎo)入人卵巢癌細(xì)胞系SKVO3中,劃痕實(shí)驗(yàn)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法測定細(xì)胞存活率;6.含有Nedd4L的真核表達(dá)載體pc DNA3.1(+)-Nedd4L導(dǎo)入人卵巢癌細(xì)胞系SKVO3中,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Nedd4L重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后,Nedd4L對卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡的影響;7.體內(nèi)觀察Nedd4L轉(zhuǎn)染后裸鼠移植瘤的生長。結(jié)果:1.NEDD4L均在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá),染色深度為淡黃至棕黃色。在10例正常卵巢組織8例陽性,在10例卵巢良性腫瘤中9例陽性,25例卵巢交界性腫瘤20例陽性,72例卵巢癌32例陽性,NEDD4L在卵巢癌組的表達(dá)率明顯低于于正常組、良性腫瘤組,差異具有顯著性(p0.01)。2.在41例早期卵巢癌組織中,NEDD4L陽性表達(dá)數(shù)分別為25例(60.9%);31例晚期卵巢癌組織中,NEDD4L陽性表達(dá)數(shù)分別為7例(22.5%)。隨著臨床分期的增高,NEDD4L陽性表達(dá)率降低,NEDD4L的表達(dá)與臨床分期差異具有顯著性(P0.01)。在18例中低級別漿液性卵巢癌中,NEDD4L蛋白陽性表達(dá)數(shù)為11例(61%);23例高級別漿液性卵巢癌中,NEDD4L蛋白陽性表達(dá)數(shù)為7例(30.4%),提示分化越差,NEDD4L的陽性表達(dá)率越低,該差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在31例粘液性卵巢癌,中低分化19例,NEDD4L蛋白陽性表達(dá)數(shù)為6例(31.5%);12例高分化中,NEDD4L蛋白陽性表達(dá)數(shù)為8例(66.6%),在31例粘液性癌中NEDD4L陽性表達(dá)數(shù)為14例(45.1%);41例漿液性癌陽性表達(dá)數(shù)為18例(43.9%),NEDD4L的表達(dá)與組織分型差異無顯著性(P0.05)。在31例已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中,NEDD4L的陽性表達(dá)數(shù)為7例(22.5%);41例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢癌組織中,NEDD4L陽性表達(dá)數(shù)為25例(60.9%)。NEDD4L的陽性表達(dá)率隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而明顯降低,兩組間表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.利用Kaplan-Meier生存曲線分析:Nedd4L的表達(dá)水平與患者疾病特異性生存率密切相關(guān),Nedd4L高表達(dá)組患者的生存時(shí)間明顯長于低表達(dá)組。Nedd4L陽性表達(dá)的腫瘤患者5年生存率為59.27%,而陰性表達(dá)的患者5年生存率為21.32%。因此,Nedd4L的陽性和陰性表達(dá)在5年存活率上存在顯著差異(P=0.02)。4.將含NEDD4L的重組表達(dá)載體pc DNA3.1(+)-Nedd4L轉(zhuǎn)染人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3,在該細(xì)胞系中NEDD4L表達(dá)水平相對較低,另外,還應(yīng)用G418篩選建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NEDD4L真核表達(dá)載體及空載體的細(xì)胞系SKOV3-NEDD4L及SKOV3-Neo。RT-PCR檢測可見:轉(zhuǎn)染NEDD4L的細(xì)胞系中均可檢測到特異性高水平NDEE4L條帶,與預(yù)計(jì)大小符合,在2200b P。westemblot鑒定示,NEDD4L蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染NEDD4L真核表達(dá)載體的細(xì)胞中較在相應(yīng)的轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中明顯較多。5.觀察體外轉(zhuǎn)染NEDD4L后對卵巢癌細(xì)胞生長及遷移形成能力的相互關(guān)系。活細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果示,SKOV3-NEDD4L細(xì)胞的增殖速度與對照組SKOV3及SKOV3-Neo相比明顯減慢(P0.001)。轉(zhuǎn)染后SKOV3細(xì)胞的形態(tài)變化SKOV3-NEDD4L組細(xì)胞的生長出現(xiàn)受抑制的特征,如細(xì)胞呈圓形,體積增大;細(xì)胞質(zhì)藍(lán)染,見較多空泡;細(xì)胞核為空泡狀,可見2~3個(gè)核仁;86%的SKOV3-NEDD4L組細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之比較SKOV3-Neo及SKOV3組細(xì)胞縮小;異染色質(zhì)凝聚、線粒體退化。透射電鏡觀察可見,SKOV3-NEDD4L組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)凋亡征象,即細(xì)胞體積增大、形態(tài)趨于一致、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之比縮小,細(xì)胞質(zhì)空泡化,核膜清晰,蛋白酶原顆粒散在,核固縮,染色質(zhì)有一定程度的聚集。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果示,劃痕24h后,SKOV3組細(xì)胞遷移距離為(147.6±14.7)μm,SKOV3-Neo組為(131.5±10.2)μm,SKOV3-NEDD4L組為(21.1±7.2)μm,SKOV3-NEDD4L組遷移距離明顯短于SKOV3-Neo和SKOV3組(P0.05)。上述結(jié)果顯示卵巢癌細(xì)胞中NEDD4L表達(dá)增加可有效降低細(xì)胞的遷移形成能力并抑制其生長。6.利用NEDD4L真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞,并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測了NEDD4L過表達(dá)對細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡的影響,正如圖8所示,在SKOV3、SKOV3-Neo、SKOV3-NEDD4L三組細(xì)胞中,NEDD4L的過表達(dá)可通過明顯增加G2或S期的細(xì)胞數(shù)目誘導(dǎo)細(xì)胞周期的阻滯;此外,還可顯著增加亞Gl期亞二倍體細(xì)胞的數(shù)目,提示NEDD4L可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。7.采用Annexin V/P丨雙染。結(jié)果顯示,NEDD4L真核表達(dá)載體經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞處理24h后,SKOV3-NEDD4L凋亡早期細(xì)胞數(shù)和凋亡晚期細(xì)胞數(shù)均有所增加(Q4:5.2±3.3%-7.6±1.2%,Q2:18.8±4.1%-35.9±6.4%),且多數(shù)細(xì)胞屬Q(mào)2象限,說明作用24h后,NEDD4L能誘導(dǎo)SKOV3凋亡,且凋亡細(xì)胞多處于凋亡晚期。8.給裸鼠分別接種SKOV3、SKOV3-Neo、SKOV3-NEDD4L細(xì)胞。6~7天后,接種SKOV3-Neo、SKOV3細(xì)胞的裸鼠都可于腋下觸及迅速生長的包塊。然而,8只接種SKOV3-NEDD4L的裸鼠在3周內(nèi)均未觸及腫瘤包塊,3周后也僅有2只可觸及很小的包塊。SKOV3-NEDD4L組平均腫瘤體積明顯小于SKOV3組及SKOV3-Neo組(0.019±0.005cm3vs 0.897±0.207cm3or 0.409±0.378cm3,P0.01)。解剖已處死的裸鼠時(shí),可在SKOV3組及SKOV3-Neo組的裸鼠中見較大瘤體且可見多個(gè)結(jié)節(jié),但是SKOV3-NEDD4L組裸鼠中則未見上述情況。對瘤體進(jìn)行免疫組化處理,結(jié)果顯示,SKOV3-NEDD4L組的瘤體與SKOV3、SKOV3-NEO組相比,NEDD4L的表達(dá)較明顯。研究結(jié)果揭示NEDD4L的表達(dá)增加可降低SKOV3細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤力,并抑制腫瘤的生長。結(jié)論:1.NEDD4L蛋白的表達(dá)在正常組織、良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤、上皮性卵巢癌組織中逐漸降低,甚至表達(dá)缺失,提示NEDD4L蛋白表達(dá)降低或缺失可能與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。腫瘤的期別越晚、分化越差,NEDD4L蛋白的表達(dá)水平越低,提示NEDD4L蛋白表達(dá)受抑制可能與上皮性卵巢癌的惡性程度有關(guān)。NEDD4L蛋白異常表達(dá)可能與上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。2.NEDD4L可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞體外增殖及轉(zhuǎn)移能力。NEDD4L誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的能力與其增殖抑制作用有關(guān)。NEDD4L在裸鼠體內(nèi),NEDD4L能降低卵巢癌細(xì)胞的成瘤能力并延長腫瘤的潛伏期。
[Abstract]:Objective: To study the expression of Nedd4L in epithelial ovarian cancer and the growth of ovarian cancer cell apoptosis, migration, invasion and other effects of biological behavior and related mechanisms, explore the target of gene therapy for ovarian cancer. Methods: 1. immunohistochemical technique was used to detect Nedd4L expression in normal ovarian tissues, ovarian benign tumor and ovarian tissue this kind of cancer in 2.; the relationship analysis of the characteristics of Nedd4L expression and clinical pathology of ovarian cancer patients by chi square test; 3. by Ka Plan-Meier analysis of Nedd4L expression and survival time of patients with a specific disease; 4. eukaryotic expression vector PC DNA3.1 by liposome transfection method containing Nedd4L (+) -Nedd4L import human ovarian cancer cell line SKVO3, using real time quantitative PCR, immunohistochemical staining and immunocytochemical staining to verify the expression of Nedd4L in ovarian cancer cells; 5. with Nedd4L really The eukaryotic expression vector PC (+) DNA3.1 scratch test -Nedd4L was transfected into human ovarian cancer cell line SKVO3, four, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method for the determination of cell viability; eukaryotic expression vector PC DNA3.1 containing 6. Nedd4L (+) -Nedd4L was transfected into human ovarian cancer cell line SKVO3, using flow cytometry Nedd4L recombinant expression vector after transfection, effects of Nedd4L on cell cycle and apoptosis of ovarian cancer cell growth in nude mice; 7. Nedd4L observed in vivo after transfection. Results: 1.NEDD4L was expressed in the cytoplasm, the dyeing depth as brown to yellow. In 10 cases of normal ovarian tissue was positive in 8 cases, 9 cases were positive in 10 cases of benign ovarian tumor, 25 cases of borderline ovarian tumors in 20 cases were positive, 72 cases of ovarian cancer and 32 cases of positive expression of NEDD4L in ovarian cancer group was significantly lower than in normal group, benign tumor group, the difference was significant (P0.01.2.) in 41 cases of early ovarian cancer ,NEDD4L闃蟲，

本文編號：1459176