發(fā)布時間：2018-01-22 23:19

  本文關鍵詞： 子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞 HGF/c-Met和Akt信號通路 腫瘤微環(huán)境　出處：《華中科技大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：[目的]腫瘤微環(huán)境除了腫瘤細胞以外,還有其周圍基質(zhì),主要由間質(zhì)細胞、免疫炎性細胞、細胞因子、趨化因子、微血管等組成的局部病理環(huán)境,既為腫瘤提供生長環(huán)境,也為腫瘤細胞與微環(huán)境相互作用提供場所,而間質(zhì)細胞在腫瘤賴以生長的微環(huán)境中扮演著重要角色。近年來有研究報道,腫瘤細胞本身的遺傳學改變決定著一部分腫瘤的發(fā)生,而另一部分則來自于腫瘤微環(huán)境改變的結(jié)果。已經(jīng)有研究證實,腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細胞在腫瘤中所發(fā)揮的作用廣泛存在于人類的許多腫瘤中,其通過某些基因和特異細胞因子的異常表達參與和調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的諸多過程：并且來自于子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞的細胞因子誘導子宮內(nèi)膜癌分化,并抑制其生長增殖。然而,其在子宮內(nèi)膜癌中的異常表達和潛在性生物學效應以及涉及的信號通路仍待進一步探討和確定。PTEN (Phosphatase and tensin homology on chromosome ten)基因是第一個具有雙特異性磷酸酶活性的的抑癌基因,通過磷脂酰肌醇3磷酸(phosphatidylinositol-3-phosphate, PIP3)去磷酸化,從而阻止細胞生長,并促進細胞發(fā)生凋亡,抑制癌前病變及癌的發(fā)生,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用,包括在子宮內(nèi)膜癌中廣泛選擇低表達。Ras基因是一種最常見的原癌基因,與腫瘤的生成,增殖、遷移、擴散、血管形成密切相關。在人類的各種腫瘤包括子宮內(nèi)膜癌中廣泛選擇高表達。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF),最早被命名為肝細胞的有絲分裂劑,主要由間質(zhì)細胞產(chǎn)生,為異二聚體結(jié)構,是一種具有多種生物學功能的重要的細胞因子。其生物學活性由單一受體c-Met (c-metproton cogene product)介導。c-Met,也叫MET和肝細胞生長因子受體(HGFR),是具有酪氨酸激酶活性的一種膜受體,通常表達上皮來源的細胞。HGF與c-Met結(jié)合激活受體,自身發(fā)生磷酸化,引起細胞內(nèi)一系列信號傳導途徑的級聯(lián)激活,在不同的細胞和組織中可以誘導出不同的反應。有研究表明,在人類的許多腫瘤中HGF/c-Met/Akt信號通路可以通過Akt激活來調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和分化,在一系列腫瘤包括子宮內(nèi)膜癌中普遍存在信號轉(zhuǎn)導異常。本研究著重于通過創(chuàng)建癌間質(zhì)細胞與正常上皮細胞體外的共培養(yǎng)體系和體內(nèi)的動物模型實驗,探索子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞(Carcinoma interstitial cells, CIC)與來源于子宮內(nèi)膜正常上皮細胞(Normal epithelial cells, NEC)之間的交互作用,同時探討PETN和RAS基因在癌間質(zhì)細胞與正常上皮細胞共培養(yǎng)微環(huán)境中的異常表達；更進一步地探討腫瘤微環(huán)境中HGF的介導作用,研究它們相互作用所涉及的信號通路,明確子宮內(nèi)膜腺癌(endometrial carcinome, EC)的間質(zhì)細胞及旁分泌因子在腫瘤進展中所發(fā)揮的關鍵作用,為提高患者生存,選擇合適的治療靶點提供有用的信息。 [方法]本研究建立了子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞和正常子宮內(nèi)膜上皮細胞的原代細胞共培養(yǎng),構建了一個旁分泌模型作為模擬子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞與正常上皮細胞之間的交互作用,用于檢測子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞對正常子宮內(nèi)膜上皮細胞增殖及腫瘤微環(huán)境中旁分泌因子HGF的介導作用,并著重研究它們可能涉及的信號分子通路和它們之間的相互作用。 1、組織標本收取和原代細胞分離培養(yǎng) 1)、臨床組織標本獲�。号R床組織樣本取自華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院和慕尼黑工業(yè)大學附屬伊薩右岸醫(yī)院婦科腫瘤中心住院的32例子宮內(nèi)膜腺癌手術患者和48例陰道流血的育齡期患者,其中21例陰道流血的患者最終的組織病理學診斷為分泌期子宮內(nèi)膜,而27例陰道流血的患者最終的組織病理學診斷為增生期子宮內(nèi)膜。所有患者手術前6個月內(nèi)未接受激素治療,樣本的獲取及實驗目的均獲得患者本人及家屬的知情同意,所有操作已經(jīng)過兩國醫(yī)學倫理委員會審核批準。 2)、原代細胞分離和培養(yǎng)：將分離獲取的子宮內(nèi)膜腺癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織用膠原酶進行消化,得到子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞和正常子宮內(nèi)膜上皮細胞與間質(zhì)細胞,使用波形蛋白(vimentin)抗體并分別通過免疫細胞化學方法對細胞進行鑒定。 3)、免疫細胞化學：分別將置于培養(yǎng)皿中獲得的子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞(CIC)、正常上皮細胞(NEC)和正常間質(zhì)細胞(NIC)三組細胞爬片,用于免疫細胞化學檢測。4%多聚甲醛固定10分鐘破膜,用5%NGS(正常山羊血清)溶液孵育30min封閉,加入兔抗人波形蛋白(vimentin)作為一抗,4℃過夜后,加入HRP標記的二抗。使用DAB進行顯色反應,適時終止反應。蘇木素復染30sec。各級酒精(70%、80%、90%、95%、100%)脫水,每級5min。中性樹膠封片,顯微鏡觀察并拍片。每個標本分別由兩名觀察者獨立評估。用PBS代替一抗,作為陰性對照組。將標本采用免疫組化的方法對染色的強度和陽性細胞數(shù)進行評分,免疫組化染色評分=染色強度得分×陽性染色細胞百分比得分。 2、子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞對正常上皮細胞增殖的影響 1)、細胞間接共培養(yǎng)：采用間接共培養(yǎng)將子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞接種在6孔共培養(yǎng)板的下室,用來提供旁分泌因子,將正常子宮內(nèi)膜上皮細胞接種于另一6孔共培養(yǎng)板的上室濾膜上,培養(yǎng)1-5天,單獨培養(yǎng)的腺癌間質(zhì)細胞被作為對照組。 2)、細胞生長曲線的測定：使用細胞生長曲線測定細胞增殖情況。將腺癌間質(zhì)細胞和正常上皮細胞接種在96孔板中共培養(yǎng),每天每組三復孔,按7天接種細胞。待4h細胞貼壁,加入CCK-8試劑,于37℃,5%CO2孵箱中放置1h,酶標儀測定450nm處的吸光度,用以確定細胞實際的起始密度,作為生長相對零點。將檢測7天的數(shù)據(jù)進行處理用Excel繪出細胞增殖曲線。 3)、Brdu摻入分析：通過檢測BrdU的摻入能夠了解細胞在S期的比例和增殖情況。采用免疫熒光方法來分析細胞中的BrdU摻入率。將正常上皮細胞接種于備好的六孔板中,孔中放置已接種腺癌間質(zhì)細胞的小室,在選定的時間點吸去培養(yǎng)液,加入BrdU培養(yǎng)液,用PBS清洗,加鹽酸(HC1)變性,加硼酸鈉溶液中和,加BSA/PBS室溫封閉,在蓋玻片四周用隔水筆劃邊界,中間劃線分為兩半,大的一半加BrdU抗體稀釋,小的一半加PBS/BSA,濕盒內(nèi)4℃C過夜,取出六孔板中的蓋玻片,細胞面朝下貼于載玻片上,顯微鏡觀察、拍照。 4)、細胞RNA提�。翰捎肨RIzol (Invitrogen)試劑抽提RNA。將六孔板中每孔加入TRIzol試劑裂解細胞,室溫放置,加入氯仿離心,用移液器吸取上清放入RNA FREE的試管中,加入不同處理因素,用酶標儀檢測RNA的濃度和純度,-80℃冰箱保存。 5)、RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA:采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega)進行cDNA合成。在無核酸酶的PCR管中依次加入RNA, Random Primer, Nuclease-Free H20試劑,將PCR管置于PCR儀中加熱、冷卻,在反應體系中再加入不同試劑,置于PCR儀中,孵育、滅活。 6)、實時定量PCR.通過PCR反應發(fā)出的熒光檢測反應體系中的熒光信號強度,進而確定PCR產(chǎn)物的含量。采用SYBR(?) Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. Dalian, China)進行實時定量PCR反應,操作儀器使用Thermal Cycler DiceTM Real Time System(TP800實時熒光定量PCR儀,TaKaRa)。定量PCR的擴增產(chǎn)物長度參照說明書要求,以80bp-150bp最為合適(可以延長至300bp)。熒光的閾值和本底信號采用實驗儀器的默認數(shù)值,每個反應管內(nèi)所采集到的熒光信號強度達到設定的閩值(基線熒光強度的10倍)時所處的循環(huán)數(shù)定義為Ct值；實驗中每個樣本平均做3復孔,目的基因的表達水平用2-AACt表示。分析了反應產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠。每個產(chǎn)品的序列被自動測序證實。 7)、蛋白印記法(WB)分析：使用蛋白裂解液將蛋白進行裂解,4℃離心收集培養(yǎng)細胞。再將蛋白提取物經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別經(jīng)過一抗、二抗孵育,TBST洗滌,最后再經(jīng)壓片、顯影、定影,采用ODYSSEY紅外成像系統(tǒng)掃膜,保存圖像。 8)、流式細胞分析(FCM)細胞周期：通過流式細胞儀完成的一種針對單個細胞進行定量分析的技術。用胰酶消化培養(yǎng)的細胞,轉(zhuǎn)移到流式專用管中,室溫離心,棄上清,收集細胞。加入預冷的乙醇固定細胞,置于-20℃冷凍保存。配制上樣緩沖液,重懸細胞,室溫避光保存10min。通過相應波長的激發(fā)光作用,PI發(fā)出的熒光強度與DNA含量成正比,以熒光強度為橫坐標,細胞數(shù)為縱坐標,利用流式細胞儀分析軟件可以得出各細胞樣本中每個周期的細胞數(shù)目。 9)、裸鼠皮下成瘤實驗：在4周齡的雄性BLAB/c nu裸鼠肩部皮下接種培養(yǎng)細胞,每只裸鼠一側(cè)接種2×106細胞,右側(cè)接種共培養(yǎng)的正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和上皮細胞,左側(cè)接種共培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞和正常上皮細胞,互為對照。待出現(xiàn)肉眼可見的腫瘤后,對瘤體的大小定期采用游標卡尺進行測量,腫瘤體積計算參照此公式：V=長*寬*寬/2。3、子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞的旁分泌作用 1)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA):將共培養(yǎng)腺癌間質(zhì)細胞和正常上皮細胞接種至24孔板,對細胞采用不同的干預,依次加入一抗、二抗、顯色底物及終止液,用ELISA kit檢測培養(yǎng)上清中HGF和PGF2a的含量,讀取對450nm波長的光吸收值。 2)、免疫組化(IHC)：將進行免疫組織化學檢測的組織樣本包括子宮內(nèi)膜腺癌(32例)和正常子宮內(nèi)膜組織(48例),經(jīng)石蠟包埋后,切片、脫蠟、水化,操作根據(jù)生產(chǎn)廠商說明進行,使用雙盲方法對結(jié)果進行隨機選擇和分析。每個標本分別由兩名觀察者獨立評估。用PBS代替一抗,作為陰性對照組。根據(jù)標本陽性細胞數(shù)和染色強度進行評分,免疫染色評分=染色強度得分×陽性染色細胞百分比得分。 4、HGF在上皮細胞增殖中的作用機制 1)、蛋白免疫印跡(WB)：使用蛋白裂解液將蛋白裂解,4℃離心收集培養(yǎng)細胞。將蛋白提取物依次按照電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,一抗(p-Akt, β-catenin, p-ERK1/2, p-NF-kB, β-actin)低溫過夜,二抗孵育30分鐘。采用ODYSSEY紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜,保存圖像。 2)、細胞生長曲線的測定：使用細胞生長曲線測定細胞增殖情況。將腺癌間質(zhì)細胞和正常上皮細胞接種在96孔板中共培養(yǎng),每天每組三復孔,按7天接種細胞。待4h細胞貼壁,加入CCK-8試劑,于37℃,5%CO2孵箱中放置1h,酶標儀測定450nm處的吸光度,用以確定細胞實際的起始密度,作為生長相對零點。將檢測7天的數(shù)據(jù)進行處理用Excel繪出細胞增殖曲線。 3)、實時定量PCR：采用SYBR(?) Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa Biotechnology Co., Ltd. Dalian, China)進行實時定量PCR反應,操作儀器使用Thermal Cycler DiceYM Real Time System (TP800實時熒光定量PCR儀,TaKaRa).定量PCR的擴增產(chǎn)物長度參照說明書要求,以80bp-150bp最為合適(可以延長至300bp)。熒光的閾值和本底信號采用實驗儀器的默認數(shù)值,每個反應管內(nèi)所采集到的熒光信號強度達到設定的閾值(基線熒光強度的10倍)時所處的循環(huán)數(shù)定義為Ct值：實驗中每個樣本平行做3復孔,目的基因的表達水平用2-AACt表示。引物序列見表2。分析了反應產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠。每個產(chǎn)品的序列被自動測序證實。 5、統(tǒng)計學分析：所得統(tǒng)計數(shù)據(jù)使用SPSS16.0軟件進行方差分析(美國芝加哥,IL)。結(jié)果采用均數(shù)±標準差的形式表示,至少有三個獨立的實驗。通過t檢驗或方差分析進行兩組或多組的比較,以P0.05認為有顯著性差異。 [結(jié)果] 1.原代細胞分離培養(yǎng)和免疫細胞化學 1.1來源于腺癌組織的間質(zhì)細胞呈長條狀,排列紊亂；來源于正常組織的間質(zhì)細胞呈梭形,排列整齊。 1.2細胞角蛋白(cytokeratin)和波形蛋白(vimentin)分別是子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞和上皮細胞的特征性蛋白。從正常子宮內(nèi)膜組織中分離獲取的上皮細胞和間質(zhì)細胞進行鑒定,其中上皮細胞cytokeratin陽性而vimentin陰性：間質(zhì)細胞則cytokeratin陰性而vimentin陽性,純度達到95%以上；從子宮內(nèi)膜腺癌組織中分離得到的間質(zhì)細胞經(jīng)免疫細胞化學鑒定,結(jié)果與正常間質(zhì)細胞類似,cytokeratin陰性而vimentin陽性,細胞純度達到95%以上。 2.子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞的旁分泌作用能夠促進上皮細胞增殖 2.1細胞間接共培養(yǎng)的方式模擬體內(nèi)的旁分泌作用實驗顯示,與腺癌間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞增長快于與正常間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞(P0.05)。提示腺癌間質(zhì)細胞分泌的某種因子對上皮細胞的增殖有促進作用。 2.2BrdU摻入的實驗顯示,與腺癌間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞處于增殖期的比例多于與正常間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞(P0.05) 2.3定量PCR結(jié)果表明,抑癌基因PTEN和癌基因K-Ras以及內(nèi)參基因β-actin都擁有銳利、單一的溶解曲線,表明所設計引物具有良好的特異性。從基因表達水平來看,正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞、子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞兩組的PTEN mRNA表達水平逐漸下降,而Ras mRNA表達水平逐漸上升。說明子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞釋放的旁分泌因子能夠使子宮內(nèi)膜上皮細胞的的抑癌基因PTEN表達水平下降,而癌基因K-Ras表達水平上升,從而使正常子宮內(nèi)膜上皮細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)換。 2.4通過免疫印跡(WB)數(shù)據(jù)分析,正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞、子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞兩組中的PTEN表達水平逐漸下降,而Ras表達水平逐漸上升,與mRNA表達水平變化趨勢一致。 2.5免疫細胞化學(ICC)的數(shù)據(jù)分析顯示,用免疫細胞化學的方法對共培養(yǎng)的上皮細胞進行染色來觀察兩個蛋白的表達水平。結(jié)果顯示,正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞、子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞兩組的PTEN蛋白表達水平逐漸下降,而K-Ras蛋白表達水平逐漸上升,與Western和qPCR趨勢一致。在顯微鏡下選取上中下左右五個視野進行染色陽性細胞計數(shù)統(tǒng)計陽性率,結(jié)果表明PTEN陽性率在第二組(NE+CI)下降明顯,而K-Ras的陽性率在第二組(NE+CI)明顯升高,結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.6細胞周期檢測結(jié)果顯示,與癌間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞G0/G1期比例降低,而S期和G2/M期細胞比例增加,表明該組細胞分裂較旺盛,增殖加快(P0.05)。 2.7實時熒光定量PCR(RT-PCR)的方法檢測下游基因Cyclin D1結(jié)果顯示,與腺癌間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞Cyclin D1表達水平較高,提示細胞增殖加快(P0.05)。 2.8通過實時熒光定量PCR的方法觀察p21和p27基因的表達水平,結(jié)果顯示,p21和p27基因在兩個共培養(yǎng)組之間表達水平均沒有明顯變化(P0.05)。表明與腺癌間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞周期改變與p21、p27的作用無明顯關聯(lián)。 2.9裸鼠皮下移植瘤的實驗結(jié)果可以看出,與腺癌組織間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞增殖速度比與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞快,瘤體大。在觀察期內(nèi),與腺癌組織共培養(yǎng)的上皮細胞移植瘤體積及重量都明顯大于與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞。 3、子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞的旁分泌作用 3.1酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗,將共培養(yǎng)72hr的細胞培養(yǎng)液用ELISA方法檢測其中的HGF和PGF2a水平。結(jié)果顯示,第二組(NE+CI)共培養(yǎng)液中HGF的濃度明顯高于第一組(NE+NI)(P0.001); PGF2a的濃度也明顯高于第二組(P0.001)。 3.2采用實時熒光定量PCR和蛋白印跡的方法檢測兩種間質(zhì)細胞中HGF的基因表達水平。結(jié)果表明,腺癌間質(zhì)細胞中HGF的基因和蛋白表達水平都明顯高于正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞,提示腺癌組織間質(zhì)細胞中HGF由于基因表達上調(diào),進而合成更多的HGF并分泌至細胞外(P0.01)。由于PGF2a是不飽和脂肪酸,無法檢測其基因表達水平。 3.3采用實時熒光定量PCR和蛋白印跡的方法檢測子宮內(nèi)膜腺癌移植瘤中HGF表達,結(jié)果顯示,與腺癌組織間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞形成的移植瘤中HGF的基因和蛋白表達水平都明顯高于與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞(P0.05)。結(jié)果進一步表明,癌間質(zhì)細胞在與上皮細胞共培養(yǎng)的過程中HGF的表達明顯上調(diào),可能是上皮細胞增殖加快的原因。 3.4采用免疫組化的實驗方法檢測正常及子宮內(nèi)膜腺癌組織中HGF的表達水平。結(jié)果表明,子宮內(nèi)膜腺癌組織的HGF表達水平明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織。 3.5通過細胞增殖曲線來觀察HGF對正常子宮內(nèi)膜上皮細胞的影響。結(jié)果表明,在培養(yǎng)液中加入細胞因子HGF,能夠促進單獨培養(yǎng)的正常子宮內(nèi)膜上皮細胞的增殖,趨勢與共培養(yǎng)的情況類似。表明細胞因子HGF具有刺激上皮細胞增殖的作用。 4、HGF在上皮細胞增殖中的作用機制 4.1采用蛋白印跡(WB)的方法進行信號通路節(jié)點的篩選,檢測幾個常見的與增殖相關的信號節(jié)點分子(β-catenin、Akt、ERK、NF-k B)的活化水平,篩選后發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化水平在與癌間質(zhì)共培養(yǎng)時有所增加,其他信號通路分子則無明顯變化。提示旁分泌的HGF可能通過激活Akt信號通路發(fā)揮作用。 4.2采用蛋白質(zhì)印跡(WB)觀察信號通路分子Akt的磷酸化情況。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),HGF刺激可以引起信號通路分子Akt活化,而Met抑制劑加入后Akt磷酸化水平降低,而腺癌間質(zhì)共培養(yǎng)組整體信號通路分子Akt的磷酸化水平比正常間質(zhì)共培養(yǎng)組高,而Met抑制劑加入后也能夠降低Akt的磷酸化水平。說明是腺癌間質(zhì)的促增殖作用是通過旁分泌HGF因子,并通過HGF-Akt信號通路實現(xiàn)的。同時通過細胞生長曲線檢測細胞增殖能力,結(jié)果觀察到HGF信號通路的抑制能夠逆轉(zhuǎn)腺癌間質(zhì)細胞旁分泌的促增殖作用,進一步證實癌間質(zhì)細胞旁分泌的促增殖作用是通過HGF信號通路發(fā)揮作用的。 4.3通過蛋白質(zhì)印跡(WB)和PCR實驗提取瘤體組織總蛋白,檢測Akt及其磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示,與腺癌間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的瘤體中Akt磷酸化水平明顯高于與正常子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的上皮細胞,表明瘤體內(nèi)Akt信號通路活化水平較高(P0.01)。 4.4采用實時熒光定量PCR的方法進一步檢測小鼠移植瘤體內(nèi)Cyclin D1基因的表達水平。結(jié)果表明,與腺癌間質(zhì)細胞共培養(yǎng)的移植瘤內(nèi)Cyclin D1表達水平較高,提示細胞增殖加快(P0.05)。 [結(jié)論] 1.通過體內(nèi)外實驗研究證實,子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞與正常子宮內(nèi)膜上皮細胞共培養(yǎng)能夠促進正常上皮細胞的增殖。 2.子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞與正常子宮內(nèi)膜上皮細胞共培養(yǎng)導致正常上皮細胞中抑癌基因PTEN表達下降,而癌基因K-Ras表達上升。 3.子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞通過基因表達上調(diào),合成、分泌細胞生長因子HGF,作用于正常上皮細胞的增殖過程。 4.HGF、c-Met的過度表達與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。 5.HGF、c-Met可促進腫瘤細胞的增殖。 6.子宮內(nèi)膜腺癌間質(zhì)細胞通過HGF/AKT/CyclinDl信號通路調(diào)控正常上皮細胞的增生。 7.阻斷HGF/c-Met的表達或信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)可作為子宮內(nèi)膜腺癌治療的新靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.33

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本文編號：1456007