本文關(guān)鍵詞： 子宮內(nèi)膜漿液性癌 小鼠模型 腫瘤發(fā)生 TP53 TP53 子宮內(nèi)膜漿液性癌 腫瘤發(fā)生 基因芯片　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一,約占女性癌瘤的7%,女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%,近20年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢。美國癌癥協(xié)會2014年的報告中顯示,美國約有52,630名女性被新確診為子宮惡性腫瘤,其中大部分是子宮內(nèi)膜癌。盡管絕大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌病例呈偶發(fā)性,但仍有少部分病例表現(xiàn)出一定程度的基因遺傳傾向。根據(jù)組織病理學(xué)特征,子宮內(nèi)膜癌被分為子宮內(nèi)膜樣癌、漿液性癌、透明細胞癌、粘液性癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、未分化癌和癌肉瘤。其中,最常見的兩種類型是子宮內(nèi)膜樣癌(endometrioid endometrial carcinoma, EEC)和子宮內(nèi)膜漿液性癌(serous endometrial carcinoma, ESC),各占子宮內(nèi)膜癌的80～90%和2%-10%。近年來,二元分類法被引入子宮內(nèi)膜癌的分類分型。在此分類方法中,依據(jù)不同的流行病學(xué)特點、臨床特征、組織學(xué)特征和分子改變,子宮內(nèi)膜癌分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌主要以EEC為主(80-90%),少部分為粘液性癌；Ⅱ型則包括ESC、透明細胞癌、未分化癌和癌肉瘤等,其中ESC占絕大多數(shù)。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌起因于無對抗的雌激素刺激,多見于50歲左右的婦女,癌組織周圍的子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)增生狀態(tài),預(yù)后較好。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌與激素水平關(guān)系不大,多見于60多歲的老年女性,癌組織周圍的子宮內(nèi)膜常表現(xiàn)為靜止狀態(tài)。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌惡性程度高,發(fā)現(xiàn)時期別較晚,相應(yīng)地預(yù)后更差。在基因突變和分子改變方面,Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌表現(xiàn)為PTEN (80%)、β-catenin (30%)和K-ras (25%)等基因的突變,而Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌,尤其ESC,則表現(xiàn)為ER和PR缺失,TP53突變和HER2的表達擴增。隨著研究的逐步深入,二元論模型分類法得到了越來越多臨床資料和分子學(xué)證據(jù)的支持,以及研究者和臨床工作者的認可。就發(fā)病過程而言,Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌現(xiàn)已明確。以子宮內(nèi)膜樣癌為例,子宮內(nèi)膜在無對抗的雌激素的作用下增生過度,進而發(fā)生復(fù)雜性增生、不典型增生,直至發(fā)展為子宮內(nèi)膜樣癌。子宮內(nèi)膜不典型增生被視為子宮內(nèi)模樣癌的癌前病變。然而,Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過程尚不明確。通過臨床病理的觀察,Zheng等人發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜漿液性癌發(fā)生發(fā)展過程中經(jīng)歷了一個中間階段,即子宮內(nèi)膜異型增生(endometrial glandular dysplasia, EmGD)。此外,子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)癌(endometrial intraepithelial carcinoma, EIC),即無浸潤的早期癌,是另一特殊的病變階段,處于EmGD和ESC之間。2011年,Zheng等人在ESC患者切除的子宮組織中發(fā)現(xiàn)一些形態(tài)正常的子宮內(nèi)膜腺體細胞中高表達p53蛋白,并將其定義為p53印記(p53 signature)。并在同一部位甚至同一腺腔中觀察到了p53印記、EmGD和EIC的同時存在。隨后,Zheng等人提出了ESC可能的發(fā)生發(fā)展過程是“靜止期子宮內(nèi)膜→p53印記→EmGD→EIC→ESC''的猜想,并推斷EmGD可能是ESC的癌前病變階段。動物模型通過模擬人的疾病發(fā)展過程,不僅可以發(fā)現(xiàn)某種疾病的演變過程和特點,更好地理解疾病發(fā)展。同時,還可為進一步研究疾病的治療方法提供合適的實驗對象,在疾病研究過程中的意義極其重要且不可取代。前期,我們進行了子宮內(nèi)膜癌免疫相關(guān)的研究,發(fā)現(xiàn)T細胞亞群中的輔助性T細胞17 (Thelper 17 cell, Th17cell)、殺傷性T細胞17 (cytotoxicity T 17 cell, Tc17 cell)、調(diào)節(jié)性T (regulartory T)細胞在子宮內(nèi)膜癌患者外周血和腫瘤局部均有顯著升高。而進一步研究子宮內(nèi)膜癌的免疫治療,急需建立動物模型以提供研究的實驗對象。轉(zhuǎn)基因小鼠模型是最常用的動物模型。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌小鼠模型現(xiàn)已有成功案例,一些包含有全身敲除或條件性敲除PTEN基因的小鼠大多能夠成功模擬從子宮內(nèi)膜單純性增生,到復(fù)雜性不典型性增生,直至EEC的整個發(fā)生發(fā)展過程。然而,Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌模型發(fā)展相對滯后。本研究主要闡述小鼠模型的建立過程及模型準確性的判斷,另對小鼠模型中發(fā)生的分子改變做了進一步分析。全文分為兩部分：一、子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型的建立二、子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型的分子研究第一部分子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型的建立研究背景和目的TP53突變是ESC基因分子水平上最顯著的特征。據(jù)統(tǒng)計,接近90%的ESC病例其免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)有p53蛋白的高表達。并且子宮內(nèi)膜癌及其早期病變中普遍存在著TP53基因的突變。在形態(tài)正常的子宮內(nèi)膜腺細胞中發(fā)現(xiàn)有p53的高表達,被稱為p53印記(p53 signature),現(xiàn)已被視為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷指標之一。研究顯示,TP53突變隨病變進展逐漸增多,p53印記、EmGD、EIC和ESC中TP53基因突變率分別為42%,43%,63%-72%和96%。此外,同一組織中不同病變階段的TP53突變有30%以上是相同的。因此,TP53基因的突變對ESC的發(fā)生發(fā)展有重要作用,可能是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動因素之一。Cre-loxP特異性重組酶系統(tǒng)是近年來應(yīng)用最廣泛的條件性基因重組方法,可以使靶基因的表達或缺失發(fā)生在試驗動物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官。若DNA序列位于兩個loxP位點之間,在Cre重組酶的作用下即可發(fā)生缺失或倒轉(zhuǎn)等序列重組。在何種組織細胞或器官中敲除某一特定的基因取決于所選擇的啟動子。選擇合適的啟動子調(diào)控Cre重組酶的表達,即可使其在生物體特定的部位、特定的條件下產(chǎn)生,實現(xiàn)相應(yīng)條件下某一特定基因的敲除。Ksp-cadherin (Cadherin 16)是鈣粘素家族中具有組織特異性的細胞粘附分子之一,能夠在腎臟特異性表達,也可在未成熟的腎盂、中腎管和苗勒氏管中少量表達。Ksp 1.3-Cre是在體細胞中Ksp-cadherin啟動子后插入一段Cre重組酶序列,從而在這些能夠表達Ksp-cadherin的組織結(jié)構(gòu)中表達Cre重組酶,相應(yīng)地敲除這些組織中被loxp序列框夾的DNA序列。Ksp1.3-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是由德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的Peter等人在2002年公開發(fā)表構(gòu)建成功的。Shao等人對Ksp 1.3-Cre小鼠各組織器官表達Cre重組酶的情況作了比較詳細的檢測。通過免疫熒光及β-半乳糖苷酶染色顯示Cre重組酶表達位置,結(jié)果顯示在雌鼠的苗勒氏管,即子宮內(nèi)膜腺上皮中有明顯表達。故Ksp 1.3-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠可作子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型的工具鼠選擇之一。鑒于1Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌與TP53的重要關(guān)系,以往大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌小鼠模型都是基于Trp53進行的。然而,這些模型雖都形成了多種類型的腫瘤。但由于小鼠壽命明顯縮短,均未發(fā)現(xiàn)有子宮內(nèi)膜癌。, Reardon等人同時敲除子宮內(nèi)膜腺細胞的Cdh1和Trp53基因建立的小鼠模型在24周齡時即出現(xiàn)了Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌(未分化癌),而進一步研究結(jié)果顯示,該模型中得發(fā)生機制多與基因敲除后引發(fā)的慢性炎癥相關(guān),且未見典型癌前病變EmGD和早期病灶EIC。本研究通過Cre-loxp條件性敲除系統(tǒng),選取Ksp1.3啟動子為Cre重組酶的組織特異性位點,特異性敲除小鼠子宮內(nèi)膜腺細胞中TP53基因,使得具有重要抑癌作用的p53蛋白表達失活,從而建立能夠呈現(xiàn)ESC完整發(fā)生發(fā)展過程的小鼠模型,進一步探究ESC的發(fā)病過程和機制。材料和方法本研究采用的工具小鼠分別是Trp53fl/fl和Ksp 1.3-Cre+/-。Trp53fl/fl是一組在其Trp53基因的第1內(nèi)含子和第10內(nèi)含子中各插入一段同方向性的loxp序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。Ksp 1.3-Cre+/-是一組Ksp 1.3啟動子后加入Cre重組酶序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。將Trp53fl/fl小鼠和ksp 1.3-Cre小鼠進行雜交后,最終得到一組基因型為Trp53Δ/Δ (Ksp 1.3-Cre+/Trp53fl/fl)的實驗組小鼠。Cre重組酶能在該實驗組小鼠的泌尿生殖系統(tǒng)中普遍的表達,相應(yīng)地在這些組織中敲除Trp53基因。另外,以同窩出生的基因型為Trp53fl/fl (WT, Trp53fl/fl)的小鼠作為正常對照。其中,實驗組和對照組的小鼠以2：1的比例,對照組48只,實驗組96只,自10周齡至80周齡,間隔2周處死。其中,10～30周齡和66～80周齡的小鼠對照組設(shè)1只,實驗組設(shè)2只；32～64周齡考慮是早期病變發(fā)生最頻繁的時期,故對照組設(shè)2只,實驗組設(shè)4只。小鼠在相應(yīng)周齡被處死后,其子宮、雙側(cè)卵巢和輸卵管、雙側(cè)腎臟、膀胱等組織用4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋,制作成蠟塊。每個蠟塊以4微米的厚度連續(xù)切片十張,依次編號,將第一張和第十張進行HE染色,鏡下排查相應(yīng)組織的病變情況。采取蛋白酶K法溶解提取鼠尾DNA,基因型鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物以瓊脂糖電泳明確各小鼠基因型。結(jié)果1.特異性敲除小鼠子宮內(nèi)膜腺細胞中的TP53基因可成功誘導(dǎo)ESC。54周齡實驗小鼠子宮內(nèi)開始發(fā)現(xiàn)ESC,陽性率為50%(4例小鼠中發(fā)現(xiàn)2例存在ESC病變)。在66周齡及以上的小鼠子宮中,ESC的發(fā)生率升至100%。2.隨周齡遞增,觀察到“RE→mGD→EIC→ESC"這一完整的發(fā)生發(fā)展過程。最早在12周齡的Trp53△/△小鼠的子宮中發(fā)現(xiàn)EmGD,在≥32周齡Trp53△/△小鼠的子宮中發(fā)現(xiàn)EIC。同時,在之54周齡Trp53△/△小鼠的子宮中發(fā)現(xiàn)ESC。并且,多種病變階段可同時存在于同一子宮、甚至同一子宮組織切面的不同腺體中。3.在10～80周齡的所有實驗組小鼠的卵巢、輸卵管、腎臟和膀胱組織中,均未發(fā)現(xiàn)病變。由于實驗組小鼠的Trp53敲除發(fā)生在泌尿生殖系統(tǒng),故對卵巢、輸卵管、腎臟和膀胱組織均做了相應(yīng)的大體解剖和病理學(xué)檢查,均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤的產(chǎn)生。4.在10～80周齡的所有對照組小鼠的子宮、卵巢和輸卵管、腎臟和膀胱中,均未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)病變。結(jié)論Tp53基因在ESC發(fā)生發(fā)展中有重要作用,特異性敲除小鼠子宮內(nèi)膜腺細胞中的Trp53基因可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜漿液性癌的發(fā)生。該模型完整呈現(xiàn)了ESC的發(fā)生發(fā)展過程,首次在動物模型中證實子宮內(nèi)膜漿液性癌存在EmGD的癌前病變階段。第二部分子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型的分子研究研究背景和目的基因突變和分子改變一直是腫瘤研究的重要方面。通過不同基因突變情況和不同分子表達情況,不僅可以獲悉疾病發(fā)展的基因?qū)W病因,同時還可以根據(jù)分子表達的不同配伍,對一類惡性腫瘤進行病理學(xué)分類,從而更好地了解腫瘤的生物學(xué)特性,指導(dǎo)臨床治療。通過臨床資料的不斷積累和分子生物學(xué)的深入發(fā)展,證實Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌不僅在流行病學(xué)特征有所不同,更重要的是在基因突變和分子改變方面有明顯的差異。研究發(fā)現(xiàn),Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌,主要涉及抑癌基因PTEN的失活(50%-80%)、Vimentin表達升高(EEC中60%)、fl-catenin(10～30% )和K-ras (20%)的突變。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌,尤其ESC,主要表現(xiàn)為TP53的突變和HER2的表達擴增,其陽性率分別為90%和16～80%。同時,ER和PR也有顯著的缺失,其表達率分別為30%和5%。此外,細胞間蛋白(例如E-cadherin和Claudin蛋白)和P16和IMP3的表達也發(fā)現(xiàn)在Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中有不同程度的升高。IMP3是近幾年發(fā)現(xiàn)的一個新的分子標記,在Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中表達有明顯差異。IMP3在ESC及其早期病變中有顯著的高表達,現(xiàn)已被應(yīng)用到ESC的鑒別和早期診斷。Zheng等人對正常子宮內(nèi)膜、各型子宮內(nèi)膜癌及其早期病變進行了比較全面的IMP3免疫組化染色分析。結(jié)果顯示IMP3在ESC及其早期病變中有顯著的高表達：14%(3/21)的EmGD病例,89%(16/18)的EIC病例以及94%(48/51)的ESC病例中均有IMP3的高表達。而其他類型的病例中IMP3的陽性表達率不超過33%,其中正常內(nèi)膜全部為陰性。Mhawech-Fauceglia等人通過對子宮內(nèi)膜癌病例的回溯性研究,ER(+)/PR(+)/IMP3(-)可作為EEC的診斷分子指標,而ESC則為ER(-)/PR(-)/IMP3(+),從而鑒別兩種最常見的子宮內(nèi)膜癌。Ksp 1.3,即Ksp-Cadherin,可表達產(chǎn)生Cdh16蛋白。Cdh16主要在胚胎前體結(jié)構(gòu)以及成年鼠的泌尿生殖系統(tǒng)中表達,本研究部分擬利用Ksp-cadherin (Cadherin16)在組織結(jié)構(gòu)中的特異性表達的特性,對實驗組小鼠子宮和輸卵管及卵巢組織進行免疫組化染色,以明確Trp53基因敲除的位置；對ESC幾個相關(guān)的特征分子(ER,PR, Vimentin和IMP3)進行免疫組化染色分析,在分子水平上以進一步明確該模型作為子宮內(nèi)膜漿液性癌模型的準確性；IMP3染色對ESC早期病變(EmGD和EIC)的評估以在分子水平上對EmGD的癌前病變角色進行初步的驗證；此外,通過全基因組表達譜芯片技術(shù),對實驗組和對照組小鼠的子宮和卵巢組織進行檢測,進一步核實Trp53基因在各組織結(jié)構(gòu)中的表達,明確其敲除效果,同時檢測在Trp53基因敲除的前提下,參與了ESC的發(fā)生發(fā)展過程的差異基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。材料和方法實驗組小鼠子宮、輸卵管和卵巢組織行Cdh16免疫組化染色；免疫組化法評價ER.PR.vimentin.IMP3等分子在模型腫瘤中的表達情況；全基因組表達譜芯片技術(shù)對Trp53△/△和Trp53fl/fl小鼠子宮和輸卵管及卵巢組織進行檢測,行差異基因分析、Pathway分析和GO分析。結(jié)果1.Cdh16免疫組織化學(xué)染色示Cre重組酶表達位置實驗組小鼠子宮和輸卵管Cdhl6免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺上皮細胞均有較強著色,輸卵管上皮細胞有少部分輕著色,而卵巢上皮均未見著色。另外,芯片結(jié)果顯示實驗組小鼠子宮組織中Cdhl6基因表達明顯高于輸卵管和卵巢組織,pTrp530.001,Fold change=7.8,FDR=0.002)2.子宮內(nèi)膜漿液性癌相關(guān)特征分子的表達情況本研究小鼠模型產(chǎn)生的腫瘤進行了相關(guān)分子的免疫組化結(jié)果示ER(20%～40%)、PR(5%)、Vimentin(5%)、IMP3(90%),與人子宮內(nèi)膜漿液性癌分子表達一致。分子表達與ESC一致。另外,實驗組小鼠和對照組小鼠子宮組織行IMP3免疫組化染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠子宮中IMP3陽性率5%,而實驗組小鼠子宮組織中正常內(nèi)膜(+／-),EmGD和EIC均呈高表達,與本研究小鼠模型中產(chǎn)生的子宮內(nèi)膜漿液性癌表達一致。3. mRNA芯片差異基因分析為明確Trp53實驗組和對照組的輸卵管及卵巢中的差異,取實驗組和對照組的輸卵管及卵巢組織各4例送檢。倍數(shù)法篩選表達差異基因結(jié)果顯示,實驗組子宮組織中共有738個差異基因,其中210個基因表達上升,528個基因表達下降。其中,實驗組子宮組織中的Trp53有明顯的下調(diào)(pTrp53= 0.006, Fold change= 3.7, FDR= 0.005);在輸卵管及卵巢組織中,未見有Trp53及其相關(guān)基因的表達改變(p0.05)。進一步確認本研究Trp53基因敲除的位置在子宮內(nèi)膜。Fold change為差異倍數(shù),FDR為對顯著性的再評價,p值0.05且FDR0.05視為差異表達。4.差異基因的生物功能分析——GO分析GO分析是利用GO數(shù)據(jù)庫對芯片結(jié)果中顯著靶向性功能的分析方法。對實驗組子宮組織芯片篩選出的差異基因進行了GO分析,在生物學(xué)進程(Biological process)中,發(fā)現(xiàn)有203項上調(diào),180項下調(diào)；在分子功能(Molecular function)中,有70項上調(diào),77項下調(diào)；在分子組分(Cellular component)中,有38項上調(diào),18項下調(diào)。5.差異基因參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析—-Pathway分析我們從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路水平進行了Pathway分析,結(jié)果顯示,實驗組子宮組織中,共有63個通路發(fā)生改變,其中22個通路上調(diào),41個通路下調(diào),如表5所示,顯著性p值均0.05。結(jié)論本研究小鼠模型Trp5-3特異性敲除的部位在子宮內(nèi)膜。模型中相關(guān)分子表達與人子宮內(nèi)膜漿液性癌的表達一致,證明了本模型的準確性,并在小鼠模型的分子水平驗證了EmGD是子宮內(nèi)膜漿液性癌的癌前病變。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33;R-332
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本文編號：1451771