本文關(guān)鍵詞： 子宮內(nèi)膜漿液性癌 小鼠模型 腫瘤發(fā)生 TP53 TP53 子宮內(nèi)膜漿液性癌 腫瘤發(fā)生 基因芯片　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見三大惡性腫瘤之一,約占女性癌瘤的7%,女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%,近20年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2014年的報(bào)告中顯示,美國(guó)約有52,630名女性被新確診為子宮惡性腫瘤,其中大部分是子宮內(nèi)膜癌。盡管絕大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌病例呈偶發(fā)性,但仍有少部分病例表現(xiàn)出一定程度的基因遺傳傾向。根據(jù)組織病理學(xué)特征,子宮內(nèi)膜癌被分為子宮內(nèi)膜樣癌、漿液性癌、透明細(xì)胞癌、粘液性癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、未分化癌和癌肉瘤。其中,最常見的兩種類型是子宮內(nèi)膜樣癌(endometrioid endometrial carcinoma, EEC)和子宮內(nèi)膜漿液性癌(serous endometrial carcinoma, ESC),各占子宮內(nèi)膜癌的80～90%和2%-10%。近年來(lái),二元分類法被引入子宮內(nèi)膜癌的分類分型。在此分類方法中,依據(jù)不同的流行病學(xué)特點(diǎn)、臨床特征、組織學(xué)特征和分子改變,子宮內(nèi)膜癌分為Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌主要以EEC為主(80-90%),少部分為粘液性癌；Ⅱ型則包括ESC、透明細(xì)胞癌、未分化癌和癌肉瘤等,其中ESC占絕大多數(shù)。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌起因于無(wú)對(duì)抗的雌激素刺激,多見于50歲左右的婦女,癌組織周圍的子宮內(nèi)膜呈現(xiàn)增生狀態(tài),預(yù)后較好。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌與激素水平關(guān)系不大,多見于60多歲的老年女性,癌組織周圍的子宮內(nèi)膜常表現(xiàn)為靜止?fàn)顟B(tài)。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌惡性程度高,發(fā)現(xiàn)時(shí)期別較晚,相應(yīng)地預(yù)后更差。在基因突變和分子改變方面,Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌表現(xiàn)為PTEN (80%)、β-catenin (30%)和K-ras (25%)等基因的突變,而Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌,尤其ESC,則表現(xiàn)為ER和PR缺失,TP53突變和HER2的表達(dá)擴(kuò)增。隨著研究的逐步深入,二元論模型分類法得到了越來(lái)越多臨床資料和分子學(xué)證據(jù)的支持,以及研究者和臨床工作者的認(rèn)可。就發(fā)病過(guò)程而言,Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌現(xiàn)已明確。以子宮內(nèi)膜樣癌為例,子宮內(nèi)膜在無(wú)對(duì)抗的雌激素的作用下增生過(guò)度,進(jìn)而發(fā)生復(fù)雜性增生、不典型增生,直至發(fā)展為子宮內(nèi)膜樣癌。子宮內(nèi)膜不典型增生被視為子宮內(nèi)模樣癌的癌前病變。然而,Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程尚不明確。通過(guò)臨床病理的觀察,Zheng等人發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜漿液性癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中經(jīng)歷了一個(gè)中間階段,即子宮內(nèi)膜異型增生(endometrial glandular dysplasia, EmGD)。此外,子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)癌(endometrial intraepithelial carcinoma, EIC),即無(wú)浸潤(rùn)的早期癌,是另一特殊的病變階段,處于EmGD和ESC之間。2011年,Zheng等人在ESC患者切除的子宮組織中發(fā)現(xiàn)一些形態(tài)正常的子宮內(nèi)膜腺體細(xì)胞中高表達(dá)p53蛋白,并將其定義為p53印記(p53 signature)。并在同一部位甚至同一腺腔中觀察到了p53印記、EmGD和EIC的同時(shí)存在。隨后,Zheng等人提出了ESC可能的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是“靜止期子宮內(nèi)膜→p53印記→EmGD→EIC→ESC''的猜想,并推斷EmGD可能是ESC的癌前病變階段。動(dòng)物模型通過(guò)模擬人的疾病發(fā)展過(guò)程,不僅可以發(fā)現(xiàn)某種疾病的演變過(guò)程和特點(diǎn),更好地理解疾病發(fā)展。同時(shí),還可為進(jìn)一步研究疾病的治療方法提供合適的實(shí)驗(yàn)對(duì)象,在疾病研究過(guò)程中的意義極其重要且不可取代。前期,我們進(jìn)行了子宮內(nèi)膜癌免疫相關(guān)的研究,發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞17 (Thelper 17 cell, Th17cell)、殺傷性T細(xì)胞17 (cytotoxicity T 17 cell, Tc17 cell)、調(diào)節(jié)性T (regulartory T)細(xì)胞在子宮內(nèi)膜癌患者外周血和腫瘤局部均有顯著升高。而進(jìn)一步研究子宮內(nèi)膜癌的免疫治療,急需建立動(dòng)物模型以提供研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。轉(zhuǎn)基因小鼠模型是最常用的動(dòng)物模型。Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌小鼠模型現(xiàn)已有成功案例,一些包含有全身敲除或條件性敲除PTEN基因的小鼠大多能夠成功模擬從子宮內(nèi)膜單純性增生,到復(fù)雜性不典型性增生,直至EEC的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過(guò)程。然而,Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌模型發(fā)展相對(duì)滯后。本研究主要闡述小鼠模型的建立過(guò)程及模型準(zhǔn)確性的判斷,另對(duì)小鼠模型中發(fā)生的分子改變做了進(jìn)一步分析。全文分為兩部分：一、子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型的建立二、子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型的分子研究第一部分子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型的建立研究背景和目的TP53突變是ESC基因分子水平上最顯著的特征。據(jù)統(tǒng)計(jì),接近90%的ESC病例其免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)有p53蛋白的高表達(dá)。并且子宮內(nèi)膜癌及其早期病變中普遍存在著TP53基因的突變。在形態(tài)正常的子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有p53的高表達(dá),被稱為p53印記(p53 signature),現(xiàn)已被視為子宮內(nèi)膜癌的早期診斷指標(biāo)之一。研究顯示,TP53突變隨病變進(jìn)展逐漸增多,p53印記、EmGD、EIC和ESC中TP53基因突變率分別為42%,43%,63%-72%和96%。此外,同一組織中不同病變階段的TP53突變有30%以上是相同的。因此,TP53基因的突變對(duì)ESC的發(fā)生發(fā)展有重要作用,可能是腫瘤發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素之一。Cre-loxP特異性重組酶系統(tǒng)是近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的條件性基因重組方法,可以使靶基因的表達(dá)或缺失發(fā)生在試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)育的某一階段或某一特定的組織器官。若DNA序列位于兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間,在Cre重組酶的作用下即可發(fā)生缺失或倒轉(zhuǎn)等序列重組。在何種組織細(xì)胞或器官中敲除某一特定的基因取決于所選擇的啟動(dòng)子。選擇合適的啟動(dòng)子調(diào)控Cre重組酶的表達(dá),即可使其在生物體特定的部位、特定的條件下產(chǎn)生,實(shí)現(xiàn)相應(yīng)條件下某一特定基因的敲除。Ksp-cadherin (Cadherin 16)是鈣粘素家族中具有組織特異性的細(xì)胞粘附分子之一,能夠在腎臟特異性表達(dá),也可在未成熟的腎盂、中腎管和苗勒氏管中少量表達(dá)。Ksp 1.3-Cre是在體細(xì)胞中Ksp-cadherin啟動(dòng)子后插入一段Cre重組酶序列,從而在這些能夠表達(dá)Ksp-cadherin的組織結(jié)構(gòu)中表達(dá)Cre重組酶,相應(yīng)地敲除這些組織中被loxp序列框夾的DNA序列。Ksp1.3-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是由德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的Peter等人在2002年公開發(fā)表構(gòu)建成功的。Shao等人對(duì)Ksp 1.3-Cre小鼠各組織器官表達(dá)Cre重組酶的情況作了比較詳細(xì)的檢測(cè)。通過(guò)免疫熒光及β-半乳糖苷酶染色顯示Cre重組酶表達(dá)位置,結(jié)果顯示在雌鼠的苗勒氏管,即子宮內(nèi)膜腺上皮中有明顯表達(dá)。故Ksp 1.3-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠可作子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)基因小鼠模型的工具鼠選擇之一。鑒于1Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌與TP53的重要關(guān)系,以往大多數(shù)子宮內(nèi)膜癌小鼠模型都是基于Trp53進(jìn)行的。然而,這些模型雖都形成了多種類型的腫瘤。但由于小鼠壽命明顯縮短,均未發(fā)現(xiàn)有子宮內(nèi)膜癌。, Reardon等人同時(shí)敲除子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞的Cdh1和Trp53基因建立的小鼠模型在24周齡時(shí)即出現(xiàn)了Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌(未分化癌),而進(jìn)一步研究結(jié)果顯示,該模型中得發(fā)生機(jī)制多與基因敲除后引發(fā)的慢性炎癥相關(guān),且未見典型癌前病變EmGD和早期病灶EIC。本研究通過(guò)Cre-loxp條件性敲除系統(tǒng),選取Ksp1.3啟動(dòng)子為Cre重組酶的組織特異性位點(diǎn),特異性敲除小鼠子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞中TP53基因,使得具有重要抑癌作用的p53蛋白表達(dá)失活,從而建立能夠呈現(xiàn)ESC完整發(fā)生發(fā)展過(guò)程的小鼠模型,進(jìn)一步探究ESC的發(fā)病過(guò)程和機(jī)制。材料和方法本研究采用的工具小鼠分別是Trp53fl/fl和Ksp 1.3-Cre+/-。Trp53fl/fl是一組在其Trp53基因的第1內(nèi)含子和第10內(nèi)含子中各插入一段同方向性的loxp序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。Ksp 1.3-Cre+/-是一組Ksp 1.3啟動(dòng)子后加入Cre重組酶序列的轉(zhuǎn)基因小鼠。將Trp53fl/fl小鼠和ksp 1.3-Cre小鼠進(jìn)行雜交后,最終得到一組基因型為Trp53Δ/Δ (Ksp 1.3-Cre+/Trp53fl/fl)的實(shí)驗(yàn)組小鼠。Cre重組酶能在該實(shí)驗(yàn)組小鼠的泌尿生殖系統(tǒng)中普遍的表達(dá),相應(yīng)地在這些組織中敲除Trp53基因。另外,以同窩出生的基因型為Trp53fl/fl (WT, Trp53fl/fl)的小鼠作為正常對(duì)照。其中,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的小鼠以2：1的比例,對(duì)照組48只,實(shí)驗(yàn)組96只,自10周齡至80周齡,間隔2周處死。其中,10～30周齡和66～80周齡的小鼠對(duì)照組設(shè)1只,實(shí)驗(yàn)組設(shè)2只；32～64周齡考慮是早期病變發(fā)生最頻繁的時(shí)期,故對(duì)照組設(shè)2只,實(shí)驗(yàn)組設(shè)4只。小鼠在相應(yīng)周齡被處死后,其子宮、雙側(cè)卵巢和輸卵管、雙側(cè)腎臟、膀胱等組織用4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋,制作成蠟塊。每個(gè)蠟塊以4微米的厚度連續(xù)切片十張,依次編號(hào),將第一張和第十張進(jìn)行HE染色,鏡下排查相應(yīng)組織的病變情況。采取蛋白酶K法溶解提取鼠尾DNA,基因型鑒定PCR反應(yīng)產(chǎn)物以瓊脂糖電泳明確各小鼠基因型。結(jié)果1.特異性敲除小鼠子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞中的TP53基因可成功誘導(dǎo)ESC。54周齡實(shí)驗(yàn)小鼠子宮內(nèi)開始發(fā)現(xiàn)ESC,陽(yáng)性率為50%(4例小鼠中發(fā)現(xiàn)2例存在ESC病變)。在66周齡及以上的小鼠子宮中,ESC的發(fā)生率升至100%。2.隨周齡遞增,觀察到“RE→mGD→EIC→ESC"這一完整的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。最早在12周齡的Trp53△/△小鼠的子宮中發(fā)現(xiàn)EmGD,在≥32周齡Trp53△/△小鼠的子宮中發(fā)現(xiàn)EIC。同時(shí),在之54周齡Trp53△/△小鼠的子宮中發(fā)現(xiàn)ESC。并且,多種病變階段可同時(shí)存在于同一子宮、甚至同一子宮組織切面的不同腺體中。3.在10～80周齡的所有實(shí)驗(yàn)組小鼠的卵巢、輸卵管、腎臟和膀胱組織中,均未發(fā)現(xiàn)病變。由于實(shí)驗(yàn)組小鼠的Trp53敲除發(fā)生在泌尿生殖系統(tǒng),故對(duì)卵巢、輸卵管、腎臟和膀胱組織均做了相應(yīng)的大體解剖和病理學(xué)檢查,均未發(fā)現(xiàn)有腫瘤的產(chǎn)生。4.在10～80周齡的所有對(duì)照組小鼠的子宮、卵巢和輸卵管、腎臟和膀胱中,均未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)病變。結(jié)論Tp53基因在ESC發(fā)生發(fā)展中有重要作用,特異性敲除小鼠子宮內(nèi)膜腺細(xì)胞中的Trp53基因可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜漿液性癌的發(fā)生。該模型完整呈現(xiàn)了ESC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,首次在動(dòng)物模型中證實(shí)子宮內(nèi)膜漿液性癌存在EmGD的癌前病變階段。第二部分子宮內(nèi)膜漿液性癌TP53基因敲除小鼠模型的分子研究研究背景和目的基因突變和分子改變一直是腫瘤研究的重要方面。通過(guò)不同基因突變情況和不同分子表達(dá)情況,不僅可以獲悉疾病發(fā)展的基因?qū)W病因,同時(shí)還可以根據(jù)分子表達(dá)的不同配伍,對(duì)一類惡性腫瘤進(jìn)行病理學(xué)分類,從而更好地了解腫瘤的生物學(xué)特性,指導(dǎo)臨床治療。通過(guò)臨床資料的不斷積累和分子生物學(xué)的深入發(fā)展,證實(shí)Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌不僅在流行病學(xué)特征有所不同,更重要的是在基因突變和分子改變方面有明顯的差異。研究發(fā)現(xiàn),Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌,主要涉及抑癌基因PTEN的失活(50%-80%)、Vimentin表達(dá)升高(EEC中60%)、fl-catenin(10～30% )和K-ras (20%)的突變。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌,尤其ESC,主要表現(xiàn)為TP53的突變和HER2的表達(dá)擴(kuò)增,其陽(yáng)性率分別為90%和16～80%。同時(shí),ER和PR也有顯著的缺失,其表達(dá)率分別為30%和5%。此外,細(xì)胞間蛋白(例如E-cadherin和Claudin蛋白)和P16和IMP3的表達(dá)也發(fā)現(xiàn)在Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中有不同程度的升高。IMP3是近幾年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的分子標(biāo)記,在Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)有明顯差異。IMP3在ESC及其早期病變中有顯著的高表達(dá),現(xiàn)已被應(yīng)用到ESC的鑒別和早期診斷。Zheng等人對(duì)正常子宮內(nèi)膜、各型子宮內(nèi)膜癌及其早期病變進(jìn)行了比較全面的IMP3免疫組化染色分析。結(jié)果顯示IMP3在ESC及其早期病變中有顯著的高表達(dá)：14%(3/21)的EmGD病例,89%(16/18)的EIC病例以及94%(48/51)的ESC病例中均有IMP3的高表達(dá)。而其他類型的病例中IMP3的陽(yáng)性表達(dá)率不超過(guò)33%,其中正常內(nèi)膜全部為陰性。Mhawech-Fauceglia等人通過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜癌病例的回溯性研究,ER(+)/PR(+)/IMP3(-)可作為EEC的診斷分子指標(biāo),而ESC則為ER(-)/PR(-)/IMP3(+),從而鑒別兩種最常見的子宮內(nèi)膜癌。Ksp 1.3,即Ksp-Cadherin,可表達(dá)產(chǎn)生Cdh16蛋白。Cdh16主要在胚胎前體結(jié)構(gòu)以及成年鼠的泌尿生殖系統(tǒng)中表達(dá),本研究部分?jǐn)M利用Ksp-cadherin (Cadherin16)在組織結(jié)構(gòu)中的特異性表達(dá)的特性,對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮和輸卵管及卵巢組織進(jìn)行免疫組化染色,以明確Trp53基因敲除的位置；對(duì)ESC幾個(gè)相關(guān)的特征分子(ER,PR, Vimentin和IMP3)進(jìn)行免疫組化染色分析,在分子水平上以進(jìn)一步明確該模型作為子宮內(nèi)膜漿液性癌模型的準(zhǔn)確性；IMP3染色對(duì)ESC早期病變(EmGD和EIC)的評(píng)估以在分子水平上對(duì)EmGD的癌前病變角色進(jìn)行初步的驗(yàn)證；此外,通過(guò)全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù),對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的子宮和卵巢組織進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步核實(shí)Trp53基因在各組織結(jié)構(gòu)中的表達(dá),明確其敲除效果,同時(shí)檢測(cè)在Trp53基因敲除的前提下,參與了ESC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程的差異基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。材料和方法實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮、輸卵管和卵巢組織行Cdh16免疫組化染色；免疫組化法評(píng)價(jià)ER.PR.vimentin.IMP3等分子在模型腫瘤中的表達(dá)情況；全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)Trp53△/△和Trp53fl/fl小鼠子宮和輸卵管及卵巢組織進(jìn)行檢測(cè),行差異基因分析、Pathway分析和GO分析。結(jié)果1.Cdh16免疫組織化學(xué)染色示Cre重組酶表達(dá)位置實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮和輸卵管Cdhl6免疫組織化學(xué)染色,結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞均有較強(qiáng)著色,輸卵管上皮細(xì)胞有少部分輕著色,而卵巢上皮均未見著色。另外,芯片結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮組織中Cdhl6基因表達(dá)明顯高于輸卵管和卵巢組織,pTrp530.001,Fold change=7.8,FDR=0.002)2.子宮內(nèi)膜漿液性癌相關(guān)特征分子的表達(dá)情況本研究小鼠模型產(chǎn)生的腫瘤進(jìn)行了相關(guān)分子的免疫組化結(jié)果示ER(20%～40%)、PR(5%)、Vimentin(5%)、IMP3(90%),與人子宮內(nèi)膜漿液性癌分子表達(dá)一致。分子表達(dá)與ESC一致。另外,實(shí)驗(yàn)組小鼠和對(duì)照組小鼠子宮組織行IMP3免疫組化染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠子宮中IMP3陽(yáng)性率5%,而實(shí)驗(yàn)組小鼠子宮組織中正常內(nèi)膜(+／-),EmGD和EIC均呈高表達(dá),與本研究小鼠模型中產(chǎn)生的子宮內(nèi)膜漿液性癌表達(dá)一致。3. mRNA芯片差異基因分析為明確Trp53實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的輸卵管及卵巢中的差異,取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的輸卵管及卵巢組織各4例送檢。倍數(shù)法篩選表達(dá)差異基因結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組子宮組織中共有738個(gè)差異基因,其中210個(gè)基因表達(dá)上升,528個(gè)基因表達(dá)下降。其中,實(shí)驗(yàn)組子宮組織中的Trp53有明顯的下調(diào)(pTrp53= 0.006, Fold change= 3.7, FDR= 0.005);在輸卵管及卵巢組織中,未見有Trp53及其相關(guān)基因的表達(dá)改變(p0.05)。進(jìn)一步確認(rèn)本研究Trp53基因敲除的位置在子宮內(nèi)膜。Fold change為差異倍數(shù),FDR為對(duì)顯著性的再評(píng)價(jià),p值0.05且FDR0.05視為差異表達(dá)。4.差異基因的生物功能分析——GO分析GO分析是利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)芯片結(jié)果中顯著靶向性功能的分析方法。對(duì)實(shí)驗(yàn)組子宮組織芯片篩選出的差異基因進(jìn)行了GO分析,在生物學(xué)進(jìn)程(Biological process)中,發(fā)現(xiàn)有203項(xiàng)上調(diào),180項(xiàng)下調(diào)；在分子功能(Molecular function)中,有70項(xiàng)上調(diào),77項(xiàng)下調(diào)；在分子組分(Cellular component)中,有38項(xiàng)上調(diào),18項(xiàng)下調(diào)。5.差異基因參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析—-Pathway分析我們從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路水平進(jìn)行了Pathway分析,結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組子宮組織中,共有63個(gè)通路發(fā)生改變,其中22個(gè)通路上調(diào),41個(gè)通路下調(diào),如表5所示,顯著性p值均0.05。結(jié)論本研究小鼠模型Trp5-3特異性敲除的部位在子宮內(nèi)膜。模型中相關(guān)分子表達(dá)與人子宮內(nèi)膜漿液性癌的表達(dá)一致,證明了本模型的準(zhǔn)確性,并在小鼠模型的分子水平驗(yàn)證了EmGD是子宮內(nèi)膜漿液性癌的癌前病變。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33;R-332
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本文編號(hào)：1451771