本文關(guān)鍵詞：酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和凋亡的影響研究　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：隨著現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展和人們生活水平的提高,飲酒成為社會(huì)交往過(guò)程中必不可少的一項(xiàng)環(huán)節(jié)。孕期飲酒可導(dǎo)致胎兒酒精綜合征(fetal alcohol syndrome, FAS)和胎兒酒精譜系障礙(fetal alcohol spectrum disorders, FASD),神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常為主要表現(xiàn)之一。鉛是一種強(qiáng)烈的的神經(jīng)毒物,發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是鉛的主要靶器官,出生前鉛暴露對(duì)大腦發(fā)育、功能和行為等均存在不良影響。神經(jīng)干細(xì)胞是不成熟的細(xì)胞,具有自我更新和多向分化潛能,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和成熟有著重要的作用。自我更新是指神經(jīng)干細(xì)胞處于未分化狀態(tài),并且保持不斷增殖的特性,而多向分化潛能是指神經(jīng)干細(xì)胞在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下能夠分化為神經(jīng)系統(tǒng)幾乎所有細(xì)胞類型的能力。鉛在環(huán)境中普遍存在,飲酒又是廣泛關(guān)注的社會(huì)問(wèn)題,鉛與酒精均能干擾神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和分化,影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能。本課題從孕14天SD大鼠的胎鼠腦皮質(zhì)分離純化神經(jīng)干細(xì)胞,研究酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和凋亡的影響和可能機(jī)制,以期為其作用機(jī)制的闡明提供科學(xué)依據(jù)。第一部分酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新的影響及機(jī)制研究1.酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)酒精和醋酸鉛聯(lián)合染毒對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞存活率的影響。與對(duì)照組相比,各酒精和鉛單獨(dú)染毒組神經(jīng)干細(xì)胞存活率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),聯(lián)合染毒組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,各聯(lián)合組細(xì)胞存活率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),且25mM+0.1μM組25mM+1μM組、50mM+0.1μM組和50mM+11μM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM鉛聯(lián)合組細(xì)胞存活率無(wú)顯著性改變(P0.05)；0.1μM和1μM鉛與各濃度酒精聯(lián)合組細(xì)胞存活率均呈下降趨勢(shì),且25mM+0.1μM組、50mM+0.1μM組和50mM+1μM組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,P0.01)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞存活率下降具有協(xié)同作用。2.酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)酒精和醋酸鉛聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,1 μM醋酸鉛單獨(dú)組及各聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞Go/G1期細(xì)胞比例升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,聯(lián)合組的神經(jīng)干細(xì)胞Go/G!期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量鉛染毒組相比,聯(lián)合組的神經(jīng)干細(xì)胞Go/G,期細(xì)胞比例均呈增加趨勢(shì),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Go/G1期細(xì)胞比例增加有協(xié)同作用。與對(duì)照組相比,酒精單獨(dú)組和0.1、11.tM醋酸鉛單獨(dú)組及各聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞S期細(xì)胞比例均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,25mM聯(lián)合組以及50mM+1μM組神經(jīng)干細(xì)胞S期細(xì)胞比例均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM醋酸鉛聯(lián)合組、0.1μM醋酸鉛聯(lián)合組以及25mM+1μM組神經(jīng)干細(xì)胞S期細(xì)胞比例均下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞S期細(xì)胞比例下降有協(xié)同作用。與對(duì)照組相比,50mM酒精單獨(dú)組及其聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例均降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,25mM酒精聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例下降,且25mM+1μM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；50mM酒精聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例無(wú)顯著改變(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM醋酸鉛聯(lián)合組、0.1μM醋酸鉛聯(lián)合組以及50mM+1μ組神經(jīng)干細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例下降有一定的拈抗作用。3.酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控基因的影響利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期抑制基因p16、p21和(?)53mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,各酒精和鉛單獨(dú)染毒組的p16mRNA表達(dá)增加,且50mM酒精組、0.01μM鉛單獨(dú)組和25 mM+0.01μM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,25 mM+0.01μM組p16 mRNA表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；50mM酒精聯(lián)合組p16 mRNA表達(dá)無(wú)顯著改變(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM鉛與各濃度酒精聯(lián)合組p16 mRNA表達(dá)顯著性增加(P0.05,P0.01);0.1μM和1μM鉛與各濃度酒精聯(lián)合組p16 mRNA表達(dá)均無(wú)顯著改變(P0.05)。低劑量鉛和低劑量酒精聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞p16 mRNA表達(dá)水平增加存在一定的協(xié)同作用,與高劑量酒精聯(lián)合染毒存在一定的拮抗作用。與對(duì)照組相比,50mM+0.01μM組p21 mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,25mM酒精聯(lián)合組p21mRNA表達(dá)水平下降,且25mM+0.1μM組25mM+1μM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；50mM+0.01μM組p21mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM鉛聯(lián)合組21mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.05)；0.1μM+25mM組p21mRNA表達(dá)水平顯著性下降(P0.05)；1μM+25mM組p21mRNA表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞p21mRNA表達(dá)水平主要表現(xiàn)為拮抗作用,高劑量酒精和低劑量醋酸鉛聯(lián)合染毒存在一定協(xié)同作用。與對(duì)照組相比,各酒精和鉛單獨(dú)染毒組的神經(jīng)干細(xì)胞p53mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢(shì),且0.1μM和1μM鉛單獨(dú)組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量酒精組對(duì)比,25mM+0.01μM組50mM+1μM組p53mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.05,P0.01)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM+25mM組p53mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.05)；0.1μM鉛和1μM鉛與各濃度酒精聯(lián)合組p53mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著改變(P0.05)。析因分析結(jié)果顯示,二者聯(lián)合染毒其交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。但是R2為0.479,該交互作用可認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的交互作用,而是否存在生物學(xué)意義顯著仍需進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。4.酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的影響利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin和Sox2 mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,50mM酒精單獨(dú)組、25mM+1μM組和50mM酒精所有聯(lián)合組NestinmRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,聯(lián)合組NestinmRNA表達(dá)水平無(wú)顯著改變(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,聯(lián)合組NestinmRNA表達(dá)水平均下降,且25mM+1μM組以及50mM酒精的所有聯(lián)合組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Nestin mRNA表達(dá)水平下降有協(xié)同作用。與對(duì)照組相比,酒精單獨(dú)染毒組和25mM+1μM組Sox2 mRNA表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,25mM酒精聯(lián)合組Sox2mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著改變(P0.05)；50mM+1μM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM和0.1μM鉛與各濃度酒精聯(lián)合組Sox2 mRNA表達(dá)水平均無(wú)顯著改變(P0.05)；1gM+25mM組Sox2 mRNA表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Sox2 mRNA表達(dá)水平的影響無(wú)交互作用。5.酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞Wnt通路相關(guān)基因表達(dá)的影響利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因C-myc和CyclinDl mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組相比,鉛單獨(dú)染毒組以及25mM+0.01μM組C-myc mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,酒精與0.01μM以及0.1μM鉛的聯(lián)合組C-myc mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.05,P0.01)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM+25mM聯(lián)合組C-myc mRNA表達(dá)顯著性增加；0.1 μM+50mM組和1 μM鉛聯(lián)合組C-myc mRNA表達(dá)水平顯箸性下降(P0.05,P0.01)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞C-myc mRNA表達(dá)水平主要表現(xiàn)為拮抗作用,低劑量酒精和低劑量醋酸鉛聯(lián)合染毒存在一定的協(xié)同作用。與對(duì)照組相比,50 mM酒精單獨(dú)組、1 μM鉛單獨(dú)組和1μM鉛聯(lián)合組CyclinD1 mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.05)。與同劑量酒精組對(duì)比,50 mM酒精與1 μM鉛聯(lián)合組CyclinD1 mRNA表達(dá)水平顯著性增加(P0.05,P0.01)。與同劑量鉛染毒組相比,1μM+25mM聯(lián)合組CyclinD1 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。二者聯(lián)合染毒可能對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞CyclinD1 mRNA表達(dá)水平的影響無(wú)交互作用。第二部分酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制研究1.酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響利用Annexin V/PI染色流式檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的凋亡率。與對(duì)照組相比,各酒精和鉛單獨(dú)染毒組的正常細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；各聯(lián)合組正常細(xì)胞比例呈明顯下降趨勢(shì),50mM+0.1μM組和50mM+1μM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量酒精組對(duì)比,各聯(lián)合組正常細(xì)胞比例呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì),且25mM+1μM組和50mM+1μM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01gM鉛聯(lián)合組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)；50mM組+0.1 μM組和50mM+1μM組正常細(xì)胞比例下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05,P0.01)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞正常細(xì)胞比例的影響無(wú)交互作用。與對(duì)照組相比,各酒精和鉛單獨(dú)染毒組的早期凋亡細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；50mM+0.1μM組和50mM+1μM組早期凋亡細(xì)胞比例增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量酒精組對(duì)比,各聯(lián)合組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,50mmM酒精聯(lián)合組早期凋亡細(xì)胞比例增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞早期凋亡細(xì)胞比例的影響無(wú)交互作用。與對(duì)照組相比,0.01μM和0.1μM鉛單獨(dú)染毒組的晚期凋亡細(xì)胞比例增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；50mM酒精和醋酸鉛聯(lián)合染毒組晚期凋亡細(xì)胞比例呈明顯的下降趨勢(shì),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量酒精組對(duì)比,各聯(lián)合組晚期凋亡細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,各聯(lián)合組晚期凋亡細(xì)胞比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞晚期凋亡細(xì)胞比例有交互作用,25mM酒精組聯(lián)合表現(xiàn)為拮抗作用,50mM酒精聯(lián)合組表現(xiàn)為協(xié)同作用。2.酒精和鉛聯(lián)合作用對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的影響本研究于神經(jīng)干細(xì)胞染毒48小時(shí)后收集神經(jīng)球,利用熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了凋亡抑制基因Bcl-2和Survivin、促凋亡基因Bax以及凋亡效應(yīng)基因Caspase3 mRNA的表達(dá)。與對(duì)照組相比,酒精和鉛單獨(dú)染毒組以及聯(lián)合染毒組神經(jīng)干細(xì)胞Caspase3 mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量酒精組對(duì)比,酒精與各濃度鉛聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞Caspase3 mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,鉛與各濃度酒精聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞Caspase3 mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Caspase3 mRNA表達(dá)水平的影響無(wú)交互作用。與對(duì)照組相比,酒精和鉛單獨(dú)染毒組以及聯(lián)合染毒組神經(jīng)干細(xì)胞5ax mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量酒精組對(duì)比,25mM酒精組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；50mM+1μM組Box mRNA表達(dá)水平增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM和0.1μM鉛與酒精聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞Box mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);50mM+1μM組顯著性降低(P0.05)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Box mRNA表達(dá)水平的影響無(wú)交互作用。與對(duì)照組相比,50mM酒精單獨(dú)組以及50mM酒精聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量酒精組對(duì)比,25mmM酒精聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)水平呈下降趨勢(shì),且25mM+1μM組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,0.01μM和0.1μM鉛與酒精聯(lián)合組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；1μM鉛與各濃度酒精聯(lián)合組神經(jīng)干細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)水平呈明顯的下降趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)水平的影響無(wú)交互作用。與對(duì)照組相比,酒精和鉛單獨(dú)染毒組以及所有聯(lián)合組的神經(jīng)干細(xì)胞Survivin mRNA表達(dá)水平顯著下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)。與同劑量酒精組對(duì)比,各聯(lián)合組Survivin mRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與同劑量鉛染毒組相比,各聯(lián)合組SurvivinmRNA表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。二者聯(lián)合染毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞Survivin mRNA表達(dá)水平下降有拮抗作用。綜上所述,酒精和醋酸鉛聯(lián)合染毒抑制神經(jīng)干細(xì)胞自我更新,促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)凋亡事件,二者聯(lián)合作用類型主要表現(xiàn)為協(xié)同作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R714.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1434605