本文關(guān)鍵詞：肌醇代謝障礙在神經(jīng)管畸形發(fā)生中的作用機(jī)制研究　出處：《北京工業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：神經(jīng)管畸形(Neural tube defects,NTDs)是最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的出生缺陷之一,發(fā)病率高,臨床后果嚴(yán)重,也是中國(guó)兒童出生缺陷的重要問(wèn)題。目前,該疾病的發(fā)生機(jī)制尚未闡明,是出生缺陷領(lǐng)域研究的重點(diǎn)難點(diǎn)之一。除葉酸外,肌醇及其代謝通路對(duì)NTDs的影響也是尚待闡明的病因?qū)W問(wèn)題之一。肌醇(Inositol)屬于維生素B族物質(zhì),是一種細(xì)胞生長(zhǎng)與存活的重要營(yíng)養(yǎng)物。研究表明,肌醇與NTDs發(fā)生密切相關(guān),肌醇及其代謝通路在胚胎發(fā)育尤其是在神經(jīng)管發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,但其確切機(jī)制尚不明確。本研究從肌醇營(yíng)養(yǎng)物代謝的角度出發(fā),應(yīng)用已建立的人類NTD出生缺陷臨床樣本資源庫(kù),并干預(yù)肌醇代謝過(guò)程中重要靶點(diǎn)酶,建立肌醇代謝障礙的NTD小鼠動(dòng)物模型;采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、免疫組化、RT-PCR及Western Blotting等技術(shù)和方法,進(jìn)一步研究肌醇代謝障礙在NTDs發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制,結(jié)果如下:1、從已建立的人類NTD樣本庫(kù)中,隨機(jī)抽取NTD及正常對(duì)照孕婦血清樣本各40例和胎兒神經(jīng)組織樣本各9例,采用GC-MS與Western Blotting方法分別對(duì)人類NTD孕婦血清肌醇水平及胎兒神經(jīng)組織PI3K/AKT信號(hào)通路活性進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)NTD孕婦血清中肌醇水平顯著低于正常對(duì)照組(1.8676±0.7270 mg/L2.5779±1.0951 mg/L,P0.05);NTD胎兒神經(jīng)組織中p AKT-S473磷酸化蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P0.05),AKT磷酸化水平提高,PI3K/AKT信號(hào)通路過(guò)度激活。2、采用Li2CO3特異性抑制C57BL/6J小鼠體內(nèi)肌醇合成代謝靶點(diǎn)酶(IMPase)活性,成功建立了肌醇代謝障礙NTD小鼠動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)孕第7.5天腹腔注射350mg/kg劑量Li2CO3為最佳造模方案,NTDs發(fā)生率高達(dá)26.7%,其主要表型腦膨出和無(wú)腦畸形。孕鼠血清中肌醇水平在350 mg/kg Li2CO3劑量注射后4~8 h期間處于最低(P0.01),16 h后仍低于正常水平(P0.05)。HE染色發(fā)現(xiàn),腦膨出小鼠胚胎神經(jīng)組織和細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,端腦神經(jīng)管閉合失敗程度較后腦更嚴(yán)重。3、在已建立的肌醇代謝障礙NTD小鼠動(dòng)物模型基礎(chǔ)上,采用免疫組化、RT-PCR及Western Blotting等方法檢測(cè)NTD小鼠胚胎神經(jīng)組織中PI3K/AKT信號(hào)通路活性及相關(guān)基因(Pten、Pik3ca、Akt1、Inpp5e)的轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)一步探討肌醇缺乏對(duì)該通路的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),p AKT-S473磷酸化蛋白主要定位于神經(jīng)上皮細(xì)胞室管膜層結(jié)構(gòu),且在NTD胚胎神經(jīng)組織的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P0.05),AKT磷酸化水平升高,PI3K/AKT信號(hào)通路過(guò)度激活;與正常對(duì)照組相比,Pik3ca基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(P0.05),Pten基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P0.05),而Inpp5e和Akt1基因轉(zhuǎn)錄水平無(wú)明顯變化。本研究結(jié)果表明,母體肌醇代謝障礙和NTDs發(fā)生密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)成功建立了肌醇代謝障礙NTD小鼠動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)肌醇缺乏可能主要通過(guò)Pik3ca和Pten基因的協(xié)同作用而過(guò)度激活端腦神經(jīng)上皮PI3K/AKT信號(hào)通路,影響神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài),干擾胎兒神經(jīng)管Closer 2閉合過(guò)程從而導(dǎo)致NTDs發(fā)生。因此,本研究結(jié)果將對(duì)肌醇在NTDs發(fā)生中作用機(jī)制的進(jìn)一步闡明及NTDs早期診斷和預(yù)防具有重要意義。
[Abstract]:Neural tube defects (NTDs) is one of the most common and serious birth defects, with high incidence and serious clinical consequences. It is also an important problem of birth defects in China. At present, the mechanism of the disease has not been elucidated, which is one of the key difficulties in the field of birth defect research. In addition to folic acid, the effect of inositol and its metabolic pathway on NTDs is also one of the aetiology problems that have yet to be elucidated. Inositol (Inositol) belongs to the vitamin B group and is an important nutrient for cell growth and survival. Studies have shown that inositol is closely related to NTDs. Inositol and its metabolic pathway play an important role in embryonic development, especially in the development of neural tube, but the exact mechanism is not clear. This study from the perspective of inositol nutrient metabolism, application of established human birth defects of NTD clinical sample resource library, and intervention of important target enzyme inositol metabolism, NTD mice to establish animal models of myo inositol metabolism; by using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), immunohistochemistry, RT-PCR and Western Blotting technology and method of further research in the mechanism of inositol metabolism, in the process of NTDs, the results are as follows: 1 samples from human NTD library has been established, randomly selected NTD and normal pregnant women serum samples of 40 cases and 9 cases of fetal neural tissue samples, using GC-MS and Western methods respectively to Blotting the activity of PI3K/AKT pathway in human NTD serum levels of inositol in pregnant women and fetal neural tissue were detected and found the levels of inositol NTD in serum of pregnant women was significantly lower than the normal control group (1.8676 + 0.7270 mg/L2. 5779 + 1.0951 mg/L, P0.05); the expression of P AKT-S473 phosphorylated protein in NTD fetal nerve tissue was significantly higher than that in the normal control group (P0.05), the level of AKT phosphorylation was increased, and PI3K/AKT signaling pathway was overactivated. 2, using Li2CO3 specific inhibitor of inositol metabolism in C57BL/6J mice target enzyme (IMPase) activity, successfully established NTD animal model of phosphoinositide metabolism disorder, found pregnant the first 7.5 days of intraperitoneal injection of 350mg/kg dose of Li2CO3 was the best modeling scheme, the incidence rate of NTDs up to 26.7%, the main phenotype and anencephaly encephalocele. The level of inositol in serum of pregnant rats was lowest (P0.01) at 4~8 h after injection of 350 mg/kg Li2CO3 (P0.01), and still lower than that of normal level after 16 h (P0.05). HE staining showed that the neural tissue and cell morphology of the encephalocele mouse embryos were changed, and the failure degree of the closure of the end of the brain was more serious than that of the posterior brain. 3, based on inositol metabolic disorders in NTD mice animal model has been established, the activity of PI3K/AKT signal pathway and related genes by immunohistochemistry, RT-PCR Western and Blotting NTD method for the detection of mouse embryonic neural tissue (Pten, Pik3ca, Akt1, Inpp5e) transcription level, to further explore the lack of regulation of the inositol pathway. The results showed that P phosphorylation of AKT-S473 protein was mainly localized in neural tube epithelial cell room film structure, and the expression of NTD in embryonic neural tissue is significantly higher than the normal control group (P0.05), increased the phosphorylation level of AKT, PI3K/AKT signaling pathway activated; compared with normal control group, the transcription level of Pik3ca gene increased significantly (P0.05). The transcription level of Pten gene decreased significantly (P0.05), and Inpp5e and Akt1 gene transcription level did not change significantly. The results of this study suggest that the maternal inositol metabolic disorder is closely related to the occurrence of NTDs. The experiment successfully established the animal model of mice NTD inositol metabolism, found that inositol deficiency may mainly through the synergistic effect of Pik3ca and Pten gene and cerebral neuroepithelial excessive activation of PI3K/AKT signaling pathway, effect of nerve tissue structure and cell morphology, interference of fetal neural tube closure process leading to Closer 2 NTDs. Therefore, the results of this study will be of great significance to the further clarification of the mechanism of inositol in the occurrence of NTDs and the early diagnosis and prevention of NTDs.
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R714.5

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