本文關(guān)鍵詞：STBM介導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)與PE發(fā)病的研究

  更多相關(guān)文章： 合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡 樹(shù)突狀細(xì)胞 成熟 免疫 子癇前期

【摘要】：背景和目的子癇前期(Pre-eclampsia,PE)是一種復(fù)雜疾病,其病因及發(fā)病機(jī)制均不明,以孕20周后母體出現(xiàn)高血壓、蛋白尿等為主要特征,PE是一種影響全身小動(dòng)脈的特發(fā)性疾病,能夠引起產(chǎn)婦和胎兒腦出血、昏迷和早產(chǎn)。PE的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)為3%-5%。盡管它的全球影響很廣泛,但是子癇前期的病因仍然不明,因此缺乏有效的預(yù)防方法。分娩是至今為止唯一確切有效的治療方法,胎兒及其附屬物娩出后,子癇前期的一系列臨床癥狀會(huì)消失,提示子癇前期是一種胎盤(pán)源性疾病。而合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡(syncytiotrophoblast-derived microvesicles,STBM)是母體釋放的胎盤(pán)源性不良因子之一。人胎盤(pán)的合體滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生和分泌大小不同、形態(tài)和功能各異的胞外囊泡狀結(jié)構(gòu),并且參與妊娠期母胎之間的對(duì)話(huà)。STBM是合體滋養(yǎng)細(xì)胞激活或凋亡時(shí)由合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞膜脫落下來(lái)的較大的囊泡(0.2-2um)。STBM脫落的同時(shí),合體滋養(yǎng)細(xì)胞會(huì)分泌外泌體(exosome),只是體積更小,直徑為納米級(jí)的(30-150nm)。STBM被釋放入血后被胎盤(pán)絨毛覆蓋,并且有對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能。STBM在母體免疫系統(tǒng)中的主要作用是促炎性免疫激活,而外泌體則能夠通過(guò)多種途徑降低母體免疫。有研究發(fā)現(xiàn)PE患者外周血中的STBM的濃度較正常的孕婦或未孕婦女高,且早發(fā)型重度子癇前期尤甚。我們課題組在前期的研究工作中也發(fā)現(xiàn)體外制備的小鼠STBM回輸同種孕鼠后,可有效誘發(fā)包括血壓升高、早產(chǎn)、高凝狀態(tài),子癇樣抽搐、腎臟和心肌損害等PE臨床表現(xiàn)和病理學(xué)改變。目前,STBM是公認(rèn)的導(dǎo)致PE發(fā)病和臨床癥狀出現(xiàn)的重要因子。免疫-炎癥反應(yīng)實(shí)際上在孕早期就存在于正常妊娠母體內(nèi),但程度輕微且受?chē)?yán)密調(diào)控,近年研究表明,PE發(fā)病的中心環(huán)節(jié)之一就是母胎免疫耐受失衡。妊娠是一種成功的半同種移植現(xiàn)象,既往研究表明正常妊娠時(shí)母體免疫狀態(tài)以Th2-Treg型免疫耐受為主,即維持母體的免疫耐受狀態(tài)從而保護(hù)胎兒免受母體免疫系統(tǒng)攻擊,妊娠得以繼續(xù);而PE時(shí)母體免疫狀態(tài)則以Th1-Th17型免疫激活為主,使全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)急劇擴(kuò)大,最終引發(fā)多器官功能病變。樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendreitic cells,DCs)是體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞,在誘導(dǎo)免疫耐受中發(fā)揮重要作用,但樹(shù)突狀細(xì)胞在妊娠免疫調(diào)節(jié)中扮演什么角色目前尚未完全闡明。有研究表明DCs具有誘導(dǎo)免疫耐受和免疫激活的雙面性,而其成熟狀態(tài)決定免疫應(yīng)答的結(jié)局。成熟的DCs表達(dá)與抗原遞呈相關(guān)的組織相容性復(fù)合物(MCHⅡ)類(lèi)分子、表面共刺激分子CD80、CD86等,可以誘導(dǎo)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng),從而使機(jī)體向Th1-Th17型免疫方向轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)母體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng);而未成熟DC(immature DCs,i DCs),將抗原遞呈給CD4+T細(xì)胞后不能將其激活,誘導(dǎo)機(jī)體向Th2-Treg方向轉(zhuǎn)移,介導(dǎo)胎兒抗原特異性免疫耐受狀態(tài)。有研究表明STBM具有激活粒細(xì)胞、誘導(dǎo)細(xì)胞免疫,調(diào)節(jié)促炎性細(xì)胞因子釋放的功能。同時(shí)STBM也可誘導(dǎo)單核細(xì)胞,引起TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等細(xì)胞因子釋放增強(qiáng),從而調(diào)節(jié)Th1-Th17/Th2-Treg免疫失衡。而DCs與粒細(xì)胞和單核細(xì)胞具有相同的前體細(xì)胞,鑒于STBM與DCs的密切關(guān)系,我們?cè)噲D通過(guò)觀察胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分化狀態(tài)的影響,初步探討STBM對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表型分化、合成分泌及抗原提呈等生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)一步明確了STBM、DCs與子癇前期發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的關(guān)系。為重建PE患者免疫監(jiān)視以維持母體免疫狀態(tài)提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù),為干預(yù)、阻斷孕晚期免疫失衡所致的全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)這一病理過(guò)程奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法:第一部分:子癇前期患者胎盤(pán)組織中樹(shù)突狀細(xì)胞的分子表達(dá)及分布特點(diǎn)1.嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)選取第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院(大坪醫(yī)院)產(chǎn)科2014年01月—2015年9月間收治的子癇前期患者(PE組)17例和正常晚孕患者(control組)20例,均取擇期剖宮產(chǎn)術(shù)后的胎盤(pán)組織。2.HE染色觀察正常妊娠胎盤(pán)組織與子癇前期患者胎盤(pán)組織的絨毛和血管的差異;3.免疫組化方法檢測(cè)正常妊娠胎盤(pán)組織與子癇前期患者胎盤(pán)組織DCs的分布狀態(tài)、部位以及數(shù)量差異性;結(jié)果:1.HE染色可見(jiàn)PE患者胎盤(pán)組織中血管腔較正常晚孕對(duì)照組的小,且血管閉塞,絨毛血液明顯灌注不足。2.免疫組化結(jié)果可見(jiàn)子癇前期患者胎盤(pán)組織中CD1a+DCs的數(shù)量較正常晚孕期組少(P㩳0.05)。3.免疫組化結(jié)果可見(jiàn)子癇前期患者胎盤(pán)組織中CD83+DCs的數(shù)量較正常晚孕期組多(P㩳0.05)。第二部分:小鼠合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡(STBM)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)分化及免疫功能的影響實(shí)驗(yàn)方法1.機(jī)械法和差速離心法制備小鼠合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡(STBM):8周齡C57BL/6小鼠,于妊娠第18天戊巴比妥麻醉后,無(wú)菌條件下剪開(kāi)小鼠串珠樣子宮取出胎盤(pán),放入消毒后的冰磷酸鹽緩沖液(PBS)中反復(fù)沖洗,直至PBS中無(wú)殘留血液和蛻膜,無(wú)菌紗布吸干水分后稱(chēng)重,無(wú)菌眼科剪將胎盤(pán)剪碎(約1mm3),按2.5g/100m L的比例加入Na Cl溶液(1%青-鏈霉素),4℃振蕩過(guò)夜,次日取上清離心:1500g,10min,取上清;10000g,60min,取上清;100000g,60min,取沉淀;4℃的PBS(含5%蔗糖)重懸。2.制備小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs):無(wú)菌條件下取6周齡雌性C57BL/6小鼠的股骨、脛骨,用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞后,應(yīng)用重組鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Recombinant mouse gramulocyre-macrophage,rm GM-CSF)和重組鼠白介素4(Recombinant mouse Interleukin-4,rm IL-4)進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs,DCs分組如下:A組:陰性對(duì)照組:DCs+PBS;B組:DCs+STBM(1.0μg/m L);C組:DCs+STBM(1.5μg/m L);D組:DCs+STBM(2.0μg/m L);E組:DCs+STBM(2.5μg/m L);F組:DCs+LPS(2.0μg/m L)。3.透射電子顯微鏡觀察鑒定STBM。將STBM稀釋40倍,滴液法制片,待樣品干燥后上機(jī)觀察。4.免疫熒光方法鑒定檢測(cè)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞。5.通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)(Flow Cyto Metry,FCM)檢測(cè)各組DCs表達(dá)CD11c和CD86的變化。6.應(yīng)用蛋白印跡法(Western Blot)檢測(cè)各組DCs表達(dá)CD80和CD86的變化。7.應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA法)檢測(cè)DCs分泌TNF-α、IFN-γ、IL-12的水平。結(jié)果:小鼠合體滋養(yǎng)細(xì)胞微泡(STBM)對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞表型及免疫功能的影響1.STBM的形態(tài)學(xué)觀察:掃描電子顯微鏡下可見(jiàn)STBM為雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu),Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)得STBM囊泡狀的直徑為0.647μm-1.438μm,平均值為(1.025±0.236)μm。2.免疫熒光可見(jiàn)培養(yǎng)至第5天簇集成團(tuán)落狀的樹(shù)突狀細(xì)胞。3.STBM刺激DCs后其表型分化:以不同濃度的STBM(1.0μg/m L、1.5μg/m L、2.0μg/m L、2.5μg/m L)作用于GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓DCs,流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)不同處理組細(xì)胞表面分子CD11c的表達(dá)水平無(wú)明顯差異性(P㧐0.05);而各組細(xì)胞CD86表達(dá)水平隨STBM濃度的升高而增加。濃度分別為1.0μg/m L、1.5μg/m L、2.0μg/m L、2.5μg/m L的STBM,其CD11c/CD86雙陽(yáng)性表達(dá)率分別為46.1±3.5%,,56.9±2.8%,60.5±3.2%,88.9±3.0%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。4.Western Blot法檢測(cè)不同濃度STBM刺激DCs后,DCs表達(dá)CD80、CD86蛋白量隨著STBM濃度的增高而逐漸增多,CD80、CD86是小鼠成熟DCs的特異性分子,其蛋白量表達(dá)越多,表明成熟DCs的數(shù)量越多。由圖可看出,STBM1.5μg/m L、STBM2.0μg/m L、STBM2.5μg/m L組與PBS(control組)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.分泌TNF-α的水平:不同濃度的STBM(STBM1.0μg/m L、2.0μg/m L、4.0μg/m L、6.0μg/m L)刺激DCs,其誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生的TNF-α的濃度分別為(6.91±1.37)pg/m L、(7.98±1.55)pg/m L、(9.40±0.93)pg/m L、(12.65±1.62)pg/m L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。分泌IFN-γ的水平:不同濃度的STBM(STBM2.0μg/m L、4.0μg/m L)刺激DCs,其誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生的IFN-γ的濃度分別為(12.14±1.39)pg/m L、(17.52±1.67)pg/m L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。分泌IL-12的水平:不同濃度的STBM(STBM2.0μg/m L、4.0μg/m L、6.0μg/m L)刺激DCs,其誘導(dǎo)DCs產(chǎn)生IL-12的濃度分別為(6.98±1.19)ng/L、(7.88±0.10)ng/L、(9.18±1.69)ng/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P㩳0.05)。結(jié)論:1.子癇前期患者胎盤(pán)組織中的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量較正常妊娠組顯著增多。提示成熟樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)量的增加可能與子癇前期發(fā)病有關(guān)。2.STBM可促進(jìn)DCs的成熟,增強(qiáng)DCs的免疫活性,同時(shí)上調(diào)TNF-α、IFN-γ和IL-12等促炎性細(xì)胞因子的水平,從而使母體系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)增強(qiáng),可能是子癇前期樹(shù)突狀細(xì)胞增多的一個(gè)原因。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R714.244

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孔令平,劉妍,黃志勤;樹(shù)突狀細(xì)胞的特性與分化發(fā)育[J];贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年02期

2 趙謹(jǐn) ,王心;樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells)[J];日本醫(yī)學(xué)介紹;2005年06期

3 張臨友,郭松,楊寶峰;激素與樹(shù)突狀細(xì)胞[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(移植與血液凈化分冊(cè));2005年05期

4 吳萍萍;杜曉英;劉書(shū)遜;陳榮軍;壽張飛;陳江華;;不同來(lái)源人樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)誘導(dǎo)及鑒定[J];浙江醫(yī)學(xué);2007年09期

5 ;封面圖片——樹(shù)突狀細(xì)胞[J];中國(guó)廠礦醫(yī)學(xué);2009年04期

6 張錦X,陳海濱,謝慶東,王駿;人血樹(shù)突狀細(xì)胞形成細(xì)胞簇功能的體外觀察[J];解剖學(xué)雜志;1997年02期

7 曹華,張銳,裴雪濤;樹(shù)突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2000年06期

8 王黎明,劉艷榮,李金蘭,常艷,付家瑜,高暉,陳珊珊;人慢性粒細(xì)胞白血病樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2000年05期

9 夏青,張學(xué)軍;真皮樹(shù)突狀細(xì)胞與皮膚病[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊(cè);2000年02期

10 劉青,金巖,吳織芬;樹(shù)突狀細(xì)胞與口腔疾病[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2000年06期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 蔣應(yīng)明;萬(wàn)濤;陳國(guó)友;夏大靜;周向陽(yáng);修方明;張意;曹雪濤;;樹(shù)突狀細(xì)胞來(lái)源的鈣粘著相關(guān)蛋白新基因的克隆、表達(dá)及功能研究[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

2 王勝軍;王麗莉;李堅(jiān);許化溪;;肺癌患者胸水中樹(shù)突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)和初步鑒定[A];中國(guó)免疫學(xué)會(huì)第四屆學(xué)術(shù)大會(huì)會(huì)議議程及論文摘要集[C];2002年

3 徐克成;牛立志;郭子倩;張德春;左建生;;樹(shù)突狀細(xì)胞及其在癌腫治療中應(yīng)用[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第十五次全國(guó)消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2003年

4 何廣勝;邵宗鴻;和虹;劉鴻;施白;潔均;曹燕然;Q，

本文編號(hào)：1307477