本文關(guān)鍵詞：選擇性抑制miR-221對卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移能力的作用

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【摘要】：目的:卵巢惡性腫瘤是女性生殖器常見的惡性腫瘤,因早期癥狀不典型且缺乏有效診斷方法,70%~80%卵巢癌患者晚期才被確診,但晚期尚無有效治療手段且易復(fù)發(fā),故卵巢惡性腫瘤的致死率位于婦科惡性腫瘤之首。上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)占卵巢惡性腫瘤85%-90%,成為最常見的卵巢惡性腫瘤。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類小的非編碼RNA,通過降解mRNA或直接抑制翻譯過程而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控作用。人們發(fā)現(xiàn)包括卵巢癌在內(nèi)的許多惡性腫瘤中均有miR-221表達(dá)水平的異常升高,從而表明miR-221過表達(dá)與腫瘤的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。血清miR-221水平上調(diào)的EOC患者,其miR-221水平與國際婦產(chǎn)科協(xié)會EOC分期及腫瘤分級密切相關(guān),血清中高表達(dá)miR-221是EOC獨(dú)立不良預(yù)后因素。相關(guān)研究顯示在人類肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等腫瘤中高水平的miR-221通過對直接靶基因如抑癌基因CDKN_1B(p27~(kip1))、CDKN_1C(p57~(kip2))、MMAC_1(PTEN)轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控而抑制細(xì)胞的凋亡,促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移。目前有研究顯示miR-221在不同腫瘤中調(diào)控的直接靶基因不同,卵巢癌中miR-221的直接靶基因尚未有報道。但Wurz K等研究結(jié)果顯示大部分卵巢腫瘤細(xì)胞中p27和p57蛋白表達(dá)量減少,而且高表達(dá)miR-221和miR-222與低p57蛋白水平相關(guān)。相關(guān)研究表明下調(diào)結(jié)腸癌及膀胱癌中miR-221水平可抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。早期卵巢癌患者5年生存率近90%,晚期病人的5年生存率只有20%~30%但卵巢癌早期不易發(fā)現(xiàn)直至晚期已有廣泛轉(zhuǎn)移才被確診,卵巢癌患者仍有近80%復(fù)發(fā),其中侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致卵巢癌患者復(fù)發(fā)的重要因素,故探究卵巢癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因及其作用,對阻止卵巢癌的侵襲和轉(zhuǎn)移具有十分重要的意義。miR-221作為致癌基因,在卵巢腫瘤細(xì)胞增殖、遷移中發(fā)揮著怎樣的作用?目前尚未見相關(guān)報道。是否可以通過選擇性抑制卵巢癌細(xì)胞中miR-221基因,阻遏卵巢癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,以期望達(dá)到控制卵巢癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的目的。本研究通過體外培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞SKOV3,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含有miR-221 sponge的質(zhì)粒,下調(diào)卵巢癌細(xì)胞SKOV3中miR-221的表達(dá)水平,觀察其對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖、遷移能力的影響,從而研究miR-221在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為卵巢癌的治療提供新思路。方法:1 按照高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒說明書中所示步驟提取兩種質(zhì)粒CAG-EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP,濃縮后測量質(zhì)粒濃度及純度。2 將細(xì)胞分組:(1)實驗組(SKOV3-miR-221 sponge),應(yīng)用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CAG-EGFP-miR-221 sponge;(2)陰性對照組(SKOV3-N),應(yīng)用Lipofectamine~(TM)2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染CAG-EGFP;(3)空白對照組(SKOV3),無處理。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染24h后細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。3 Real-time PCR:用SYBRGreen法進(jìn)行熒光實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染48小時后各組基因miR-221的表達(dá)量。4 MTS法檢測各組SKOV3細(xì)胞0h、24h、48h、72h增殖能力。5 細(xì)胞劃痕實驗:“十”字劃痕法評估各組SKOV3細(xì)胞的遷移能力。6 統(tǒng)計方法:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±S)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實驗重復(fù)三次。結(jié)果:1 鑒定質(zhì)粒CAG-EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP的純度及濃度兩種質(zhì)粒純度A260/A280為1.8,濃度在700ng/uL左右。2 轉(zhuǎn)染效果的觀察轉(zhuǎn)染CAG-EGFP-miR-221 sponge、CAG-EGFP24h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞有無綠色熒光,未轉(zhuǎn)染組無熒光,說明轉(zhuǎn)染,觀察帶有綠色熒光細(xì)胞比例。結(jié)果顯示SKOV3-miR-221 sponge組轉(zhuǎn)染率為70%-80%,SKOV3-N組轉(zhuǎn)染率為60%-70%,SKOV3組無熒光表達(dá)。3 Real-time PCR檢測各組miR-221的表達(dá)水平實時定量PCR對各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48小時后miR-221的表達(dá)水平:SKOV3-miR-221spong組1.172±0.025;SKOV3-N組1.852±0.019;SKOV3組1.921±0.023;SKOV3-miR-221 sponge組與SKOV3-N組、SKOV3組相比,miR-221的表達(dá)量明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05),SKOV3-N組與SKOV3組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4 MTS法檢測各組細(xì)胞不同時間增殖情況0小時:SKOV3-miR-221 sponge組0.344±0.0318,SKOV3-N組0.370±0.043,SKOV3組0.390±0.047,實驗組與對照組相比P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;24小時:SKOV3-miR-221 sponge組0.421±0.068,SKOV3-N組0.510±0.041,SKOV3組0.561±0.059;SKOV3-miR-221 sponge組與SKOV3-N組相比P㩳0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,SKOV3-miR-221 sponge組與SKOV3組相比P㩳0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,SKOV3-N組與SKOV3組相比P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;48小時:SKOV3-miR-221 sponge組0.518±0.0499,SKOV3-N組0.614±0.035,SKOV3組0.709±0.038,實驗組與對照組相比P㩳0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;72小時:SKOV3-miR-221 sponge組0.5827±0.091,SKOV3-N組0.719±0.026,SKOV3組0.816±0.038,實驗組與對照組相比P㩳0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5 細(xì)胞劃痕實驗檢測各組細(xì)胞的遷移能力Image J軟件分析劃痕實驗結(jié)果,計算劃痕后24小時遷移率:SKVO3-miR-221 sponge組(17.39±5.28)%;SKOV3-N組(24.55±2.641)%;SKOV3組(21.01±3.74)%;實驗組與對照組比較P㩳0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1下調(diào)miR-221可顯著降低卵巢癌細(xì)胞SKVO3的增殖能力。2下調(diào)miR-221可顯著降低卵巢癌細(xì)胞SKVO3的遷移能力。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

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本文編號：1213411